A.I. Polinova, D.R. Zagirova, L.Yu. Kokaeva, I.I. Buško, I.V. Levantsevich, S.N. Elansky
Posljednjih godina u Bjelorusiji se značajno pogoršalo fitosanitarno stanje zasada krompira i sjemenskog fonda. Promijenjena je uloga pojedinih vrsta štetočina i njihov odnos u agrofitocenozama. Povećana je štetnost mnogih ne samo rasprostranjenih bolesti (kasna plamenjača, alternaria, sve vrste krastavosti, bakterioza, suha trulež Fusarium), već i novih koje nisu dovoljno proučene, poput vodene truleži rane (Sl. 1). Ova bolest, pronađena u Indiji, Centralnoj Aziji i drugim južnim zemljama, zabilježena je u regijama Gomelj, Brest, Grodno i Minsk u Bjelorusiji. Kao i drugi oomiceti koji žive u tlu, P. ultimum izaziva masivne lezije u uslovima prekomerne vlage – u slabo dreniranim područjima, tokom dugotrajnih kiša (Taylor et al., 2008).
U Bjelorusiji je širenje bolesti zabilježeno u godinama sa povišenim temperaturama tokom vegetacije: u nekim serijama krompira bilo je zahvaćeno 8-10% gomolja. Rana vodena trulež gomolja može uzrokovati značajna oštećenja, koja su uzrokovana nedostatkom otpornih sorti, razvijenim zaštitnim mjerama i brzim razvojem bolesti kada su gomolji oštećeni (Zhuromskaya, 2003; Ivanyuk et al., 2005). Bolest pogađa samo krtole. U Rusiji vodena trulež na ranama još nije od značajnog značaja.
U ovom radu proučavali smo 4 soja patogena vodenaste truleži izolovanih iz zaraženih gomolja krompira sorti Vektar Beloruski, Skarb i selekcijskih hibrida u skladištima Naučno-praktičnog centra Nacionalne akademije nauka Belorusije za krompir i hortikulturu. (Minska oblast). Ciljevi istraživanja uključivali su određivanje vrste izolovanih izolata, njihove virulencije na gomolje krompira, procenu rasta na različitim temperaturama okoline i otpornosti na metalaksil.
Micelij izolata uzgajan je na tečnom mediju graška (180 g smrznutog zelenog graška se kuva 10 minuta u 1 litru destilovane vode, zatim autoklavira 30 minuta na 1 atm); DNK je izolovan iz svakog soja. Za izolaciju DNK, smrznuti micelij je samljeven u tekućem dušiku, liziran u CTAB puferu, a zatim deproteiniziran hloroformom. DNK je pohranjena u dejoniziranoj vodi na –20°C. Analiza nukleotidnih sekvenci specifičnih za vrstu regiona genoma (regije nuklearnih ribosomalnih gena 18S i 5,8S, kao i internog transkribovanog intergenskog razmaknice ITS1), amplificiranih prajmerima ITS1 i ITS2 (White, 1990.), pokazala je da proučavani sojevi pripadaju vrsti Pythium ultimum Trow. (sinonim Globisporangium ultimum (Trow) Uzuhashi, Tojo & Kakish).
Svi ispitivani sojevi zahvatili su kriške gomolja krompira sorte Gala smeštene u vlažne komore. Na njima su se formirale tamne mrlje koje su se kasnije pretvorile u vlažne, duboko penetrirajuće čireve (slika 2). Infekcija je izvršena postavljanjem micelija P. ultimum u centar kriške gomolja.
Inokulisani diskovi gomolja inkubirani su na temperaturi od +22°C. Maksimalna stopa rasta zahvaćenog područja primijećena je u prva 2 dana, a zatim se područje čira praktički nije promijenilo.
Ovaj obrazac je bio istinit za sve proučavane sojeve.
Brzina rasta sojeva je procenjena na medijumu sa zobenim agarom na temperaturama od 5, 15, 24 i 34°C (slika 3). Rast je uočen na svim temperaturama; maksimalna stopa rasta je primećena na 24°C (čaša od 86 mm je potpuno prerasla za 2 dana). Na 15 i 34°C stopa rasta je bila značajno niža (čaša je prerasla za 4, odnosno 3 dana).
Na temperaturama od 15, 24 i 34°C, stope rasta svih proučavanih sojeva nisu se razlikovale. Na temperaturi od 5°C soj P1 je rastao značajno brže od ostalih (20. dan 4 mm), P4 – nešto sporije (10 mm 4. dan), P2 i P3 praktično nisu rasli.
Također treba napomenuti da je pri temperaturi od 24°C rast počeo odmah nakon sadnje u posudu, pri temperaturama od 15 i 34°C došlo je do kašnjenja početka aktivnog rasta za 1 dan, a na 5°C – za 2 dana.
Metalaksil (i njegov izomer mefenoksam) su prepoznati kao najefikasniji lijekovi za kontrolu oomiceta u tlu. Metalaxyl može prodrijeti u gomolje i pružiti (čak iu vrlo niskim koncentracijama) njihovu dugotrajnu zaštitu (Taylor et al., 2008., Bruin et al., 1982.). Međutim, efikasnost metalaksila naglo opada nakon pojave rezistentnih sojeva u populacijama. Visoko otporni sojevi pronađeni su u nekoliko regija Sjedinjenih Država (Taylor et al., 2002). Ne postoje podaci o rezistenciji bjeloruskih sojeva P. ultimum na metalaksil, pa je odlučeno da se u ovom radu ispita njihova otpornost na lijek.
Ispitivanje osjetljivosti na fungicid metalaksil provedeno je na mediju od zobenog agara uz dodatak fungicida u različitim koncentracijama (Pobedinskaya, Elansky, 2014).
Ispitivani sojevi su imali određene razlike u otpornosti na metalaksil (tabela 1). Tako je pri koncentraciji fungicida od 1 mg/l rast soja P4 potpuno zaustavljen, a rast preostalih sojeva uvelike usporen. Sojevi P1 i P2 rasli su vrlo sporo na podlozi sa koncentracijom metalaksila od 10 mg/l. Izračunata efektivna koncentracija EC50 (koncentracija fungicida koja usporava brzinu rasta soja za 2 puta u odnosu na kontrolu) za sve sojeve bila je manja od 1 mg/l. Dakle, svi testirani sojevi bili su osjetljivi na metalaksil; pokazao se veoma efikasnim u inhibiciji rasta P. ultimum.
Prema Bruin et al. (1982) nakon tretiranja biljaka tokom vegetacije metalaksilom u dozi od 0,5 kg/ha, akumulacija fungicida u gomoljima iznosila je 0,055 μg/g u peridermu, 0,022 μg/g u kortikalnom sloju i 0,034 μg/g u središnji dio gomolja. Prema našim podacima, ova koncentracija metalaksila nije dovoljna za suzbijanje bolesti, ali može usporiti njen razvoj.
Pri uzgoju na podlozi ovsa, svi sojevi su u monokulturi formirali oospore (slika 4), što je tipično za P. ultimum. Spajanje sojeva u paru nije otkrilo vidljive simptome vegetativne nekompatibilnosti - posude su bile ravnomjerno prekrivene micelijem.
Dobijeni podaci pokazuju da je P. ultimum fitopatogen sposoban za brzi rast u širokom rasponu temperatura, uključujući i temperaturu skladištenja od 5°C. Virulentan je za tkiva gomolja krompira i formira oospore sposobne za dugotrajnu održivost. Dakle, ova vrsta je opasan fitopatogen koji može predstavljati prijetnju poljoprivredi i potrebno je dodatno proučavanje.
Istraživanje je sprovedeno uz podršku Ruske naučne fondacije (projekat N 14-50-00029).
Tabela 1. Osetljivost sojeva P. ultimum na metalaksil
Procijediti | Koncentracija metalaksila, mg/l | ||
0 (kontrola) | 1 | 10 | |
P1 | 63 | 6 | 0 |
P2 | 65 | 5 | 0 |
P3 | 59 | 0 | 0 |
P4 | 61 | 0 | 0 |
P1 | 105 | 10 | 3 |
P2 | 110 | 10 | 3 |
P3 | 95 | 0 | 0 |
P4 | 98 | 0 | 0 |
Bilješka Dati su prosječni podaci za 3 mjerenja.
Članak je objavljen u časopisu "Zaštita krompira" (br. 1, 2017)