D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fitopatogena gljiva Colletotrichum coccodes uzrokuje opasne bolesti krompira i paradajza, poznate kao antraknoza i crna pjegavost gomolja. Na osnovu morfoloških karakteristika, često ih je teško razlikovati od bolesti uzrokovanih drugim mikroorganizmima; Na zelenim plodovima paradajza bolest može biti asimptomatska, javlja se samo na zrelim crvenim plodovima. Za brzu i tačnu dijagnozu patogena nudi se PCR test sistem u realnom vremenu. Za razvoj test sistema, nukleotidna sekvenca gena glicerol trifosfat dehidrogenaze određena je za 45 sojeva kokoda C. izolovanih iz gomolja krompira u različitim regionima Rusije.
Na osnovu dobijenih rezultata i analize sličnih sekvenci drugih vrsta dostupnih u bazi podataka GenBank, dizajnirani su prajmeri specifični za vrstu i sonda za C. coccodes. Kako bi se provjerila specifičnost kreiranog test sistema, PCR je obavljen sa DNK izolovanom iz čistih kultura 15 različitih vrsta parazitskih i saprotrofnih gljiva povezanih sa biljkama paradajza i krompira (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prisustvo Colletotrichum coccodes DNK detektovano je na pragu ciklusa od 20-27, dok su druge vrste otkrivene nakon 40 ciklusa ili nisu otkrivene. Test sistem vam omogućava da pouzdano detektujete koncentracije DNK C. coccodes koje prelaze 0.01 ng/mm3 u analiziranoj PCR mešavini. Koristeći razvijen test sistem, proučavano je prisustvo C. kokoda u listovima paradajza sa simptomima gljivičnih oboljenja i u krtolima krompira bez spoljašnjih simptoma bolesti. Listovi sa simptomima gljivične infekcije sakupljeni su sa dva različita polja u Krasnodarskom kraju, gomolji - sa polja u oblastima Kostroma, Moskva, Kaluga i Nižnji Novgorod. U Krasnodarskom kraju pronađen je jedan list paradajza koji sadrži DNK C. coccodes; pouzdano prisustvo DNK ovog patogena otkriveno je u 5 uzoraka gomolja uzgojenih u regijama Kostroma, Moskva i Kaluga.
Uvod
Gljive iz roda Colletotrichum su opasni fitopatogeni koji napadaju žitarice, povrće, začinsko bilje i višegodišnje voće i bobičasto bilje. Jedna od sveprisutnih vrsta ovog roda, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughesa, uzročnik je antraknoze i crne pjegavosti krompira i paradajza, te uzrokuje bolesti niza drugih biljaka iz porodice velebilja, uklj. korov (Dillard, 1992). C. coccodes inficira sve podzemne dijelove biljke, osnove stabljike, listove i plodove (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Na kožici zaraženih gomolja krompira uočava se razvoj sivih mrlja sa nejasno definisanim ivicama na kojima su jasno vidljive crne mrlje sporulacije i mikrosklerocije. U toku skladištenja u pulpi gomolja mogu nastati čirevi sa omekšanim sadržajem, tj. bolest ulazi u fazu antraknoze, što je, međutim, izuzetno rijetko.
Istovremeno, simptomi antraknoze (čirevi prekriveni kožom sa malim crnim tačkama) su tipični za plodove paradajza. Na listovima se simptomi lezija C. coccodes pojavljuju kao tamno smeđe mrlje, obično oivičene žutim tkivom (Johnson, 1994).
Razvoj crnih mrlja na gomoljima narušava njihov izgled, što je posebno izraženo kod prodaje opranog crvenog krompira. Odvajanje kore dovodi do prekomjernog isparavanja i povećanih gubitaka pri skladištenju (Hunger i McIntyre, 1979.). Oštećenja drugih biljnih organa dovode do gubitaka prinosa, što je zabilježeno iu otvorenom iu zatvorenom tlu (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Bolesti uzrokovane C. coccodes česte su u gotovo svim regijama svijeta koje se bave proizvodnjom krumpira, uključujući i Rusiju (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrola ovih bolesti je otežana zbog nedovoljne efikasnosti postojećih fungicida protiv C. kokoda i nedostatka otpornih sorti (Read and Hide, 1995).
Inokulum C. kokoda može se sačuvati u sjemenskim gomoljima (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), sjemenu paradajza (Ben-Daniel et al., 2010) i dugo preživjeti u tlu i na biljnim ostacima (Dillard, 1990; Dillard, Cobb, 1993) i u korovima (Raid, Pennypacker, 1987). Radovi brojnih autora (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) pokazali su da razvoj bolesti na krompiru i paradajzu u velikoj meri zavisi od prisustva inokuluma u sjemenskom materijalu i zemljištu. Stoga, da bi se minimizirali gubici od bolesti, potrebno je dijagnosticirati (uključujući kvantitativne) gljivične propagule u sjemenskom materijalu, u tlu, u sjemenskim gomoljima krumpira i sjemenu paradajza koji se čuva za skladištenje. Morfološka dijagnostika u tlu i biljnom materijalu može se provesti samo prisustvom mikrosklerocija, koji se, međutim, nalaze i kod drugih vrsta gljiva.
Simptomi na krtolama su vrlo slični srebrnoj krastavosti koju uzrokuje gljiva Helminthosporium solani. Izolacija Colletotrichum coccodes i Helminthosporium solani u čistu kulturu je prilično teška i dugo traje zbog sporog rasta na hranljivoj podlozi. Da biste brzo identificirali Colletotrichum coccodes, potrebno je koristiti instrumentalne dijagnostičke metode. Najprikladnija metoda je lančana reakcija polimeraze (PCR) i njena modifikacija - PCR u realnom vremenu. Trenutno se u Evropi i SAD-u koristi test sistem koji su razvili engleski istraživači (Cullen et al., 2002) za ITS1 region rDNK. Njegova upotreba je također pokazala dobre rezultate u analizi ruskih izolata (Belov et al, 2018). Međutim, C. coccodes je vrlo varijabilan i njegovo otkrivanje korištenjem jedne sekvence DNK može dovesti do lažno negativnih rezultata. Za veću dijagnostičku pouzdanost potrebna je analiza nekoliko vrsta specifičnih DNK sekvenci, pa smo razvili originalni test sistem koji nam omogućava da identifikujemo kokode C. po sekvenci gena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze.
materijali i metode
Za procenu efikasnosti i specifičnosti kreiranih test sistema korišćene su čiste kulture 15 vrsta gljiva koje su autori izolovali iz zaraženih uzoraka listova i plodova paradajza i krtola krompira (tabela 1). Za izolaciju su uzeti biljni organi sa simptomima gljivične infekcije, ne više od jednog organa po grmu.
Odsječak gomolja sa korom, kriška ploda paradajza ili zahvaćeni list stavljeni su pod binokularni mikroskop, nakon čega su micelij, spore ili komadić tkiva prebačeni u agar podlogu (agar sladovine) u Petrijevoj posudi. sa oštro naoštrenom iglom za seciranje. Izolati su čuvani na kosim agarima u epruvetama na 4°C.
Uzorci listova paradajza namijenjeni za analizu sa simptomima gljivičnih oboljenja neposredno nakon sakupljanja (na terenu) stavljani su u 70% etil alkohol u kojem su čuvani do ekstrakcije DNK. Gomolji krompira su dopremljeni u laboratoriju, oguljeni (komad 2 × 1 cm) i zamrznuti na –20°C. Čuvani su zamrznuti do ekstrakcije DNK.
Čiste kulture gljiva za ekstrakciju DNK uzgajane su u tečnom mediju graška. Gljivični micelij je uklonjen iz tečnog medijuma, osušen na filter papiru, zamrznut u tečnom azotu, homogenizovan, inkubiran u CTAB puferu, prečišćen hloroformom, precipitiran sa mešavinom izopropanola i 0.5 M kalijum acetata i ispran dva puta sa 2% alkohola . Dobijena DNK je rastvorena u dejonizovanoj vodi i čuvana na –70°C (Kutuzova i sar., 20). Koncentracija DNK je mjerena korištenjem HS DNK kita za kvantifikaciju dvolančane DNK na Qubit 2017 (Qiagen, Njemačka). Konzervirani i smrznuti uzorci su mljeveni u tekućem dušiku, zatim je DNK izolirana kako je gore opisano (za micelijum čistih gljivičnih kultura).
Tabela 1. Porijeklo sojeva gljiva korištenih u radu
Naziv gljive | biljka, organ | Mjesto odabira |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | gomolja krompira | Kostromska oblast, gomolji krompira 1. poljske generacije, sorta Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | list krompira | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | gomolja krompira | Magadan region, pos. Šator, krtola krompira |
Cladosporium fulvum | list paradajza | Moskovska oblast, paradajz sa velikim plodovima |
Alternaria tomatophila | voće paradajza | prenijeli zaposleni u laboratoriji za mikologiju i fitopatologiju Sveruskog istraživačkog instituta za zaštitu bilja |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | voće paradajza | Krasnodarski kraj, Krimski okrug, sorta Slivka |
Fusarium oxysporum | koren pšenice | Područje Moskve |
PCR je izveden korištenjem DTprime pojačivača (DNA-Technology). Za izvođenje PCR-a koristili smo originalne prajmere i sondu za vrstu specifičnu regiju gena glicerol trifosfat dehidrogenaze: prednji prajmer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGCA, reverzni prajmer Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGGA – sonda CocgQGTGA – sonda CocgQGFDz) GGGCTGCTGCCG(p). Prajmeri pojačavaju region od 1 bp.
Reakcija je uključivala 50 ng ukupne DNK (prilikom analize listova i gomolja) i 10 ng (prilikom analize DNK iz čistih gljivičnih kultura). Reakciona smjesa (35 μl) podijeljena je na dva dijela parafinskim slojem: donji (20 μl) je sadržavao 2 μl 10× reakcionog pufera (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween-20), 0.5 mM svakog deoksinukleotid trifosfata, 7 pmol svakog prajmera i 4 pmol hidrolizabilne fluorescentne sonde; gornji je sadržavao 1 μl 10× PCR pufera i 1 jedinicu Taq polimeraze.
Odvajanje smeše sa parafinom omogućava da se epruvete čuvaju duže vreme na temperaturi od 5°C i da se obezbedi vrući početak PCR-a nakon što su zagrejane 10 minuta na temperaturi iznad 80°C. PCR je obavljen prema sledećem programu: 94.0°C – 90 s (1 ciklus); 94.0°C – 30 s; 64.0°C – 15 s (5 ciklusa); 94.0°C – 10 s; 64.0°C – 15 s (45 ciklusa); 10.0°C – skladištenje.
Rezultati i rasprava
Sekvence gena glicerol trifosfat dehidrogenaze određene su u 45 sojeva izolovanih iz listova, stabljike, gomolja krompira i plodova paradajza (Kutuzova, 2018) u različitim regionima Rusije. Proučavane sekvence svih sojeva podijeljene su u 2 grupe, koje se razlikuju po dva nukleotida. Nukleotidne sekvence predstavnika obe grupe deponovane su u GenBank pod brojevima KY496634 i KY496635.
Prajmeri coc70gdf, coc280gdr i cocgdz sonda konstruisana na njihovoj osnovi provereni su programom BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na svim sekvencama gena glicerol trifosfat dehidrogenaze koje su dostupne u bazi podataka GenBank od vrsta iz roda Colletotrichum i drugih organizama.
Nisu pronađeni DNK regioni drugih organizama koji su visoko homologni prajmerima i sondi.
Osetljivost test sistema testirana je na uzorcima sa različitim koncentracijama DNK C. coccodes, DNK iz lista krompira zahvaćenog antraknozom (sakupljeno 2017. godine u Mari El, sorta Red Scarlett), i kore gomolja zahvaćene crnom pjegavosti (sakupljene u region Kostroma, sorta Red Scarlett, tabela 2). Da bi se potvrdilo prisustvo DNK u gomoljima i listovima krompira, iz njih su izolovani sojevi C. coccodes u čiste kulture.
Rezultati analize osetljivosti test sistema pokazuju da se njime može uspešno dijagnostikovati prisustvo C. coccodes DNK u uzorku ako je njegov ukupan sadržaj u PCR smeši veći od 0.05 ng. Ovo je sasvim dovoljno za detekciju, jer jedna sklerocija sadrži u prosjeku 0.131 ng, a jedna spora oko 0.04 ng DNK (Cullen et al., 2002). Test sistem koji je razvila engleska grupa (Cullen et al., 2002) pokazao je sličnu osjetljivost (prag ciklusa 34 na 0.05 ng DNK i 37 na 0.005 ng).
Analiza prirodnih uzoraka koji sadrže kokode C. u svim slučajevima omogućila je pouzdano otkrivanje njegovog prisustva u uzorku (tabela 2). Pokazalo se da je predložena metoda za ekstrakciju DNK primjenjiva i za analizu prirodnih biljnih uzoraka.
Tabela 2. Određivanje osjetljivosti predloženog sistema za identifikaciju Colletotrichum coccodes za PCR u realnom vremenu
Obrazec | Količina DNK u uzorku*, ng | Ciklus praga | Detekcija C. kokoda |
---|---|---|---|
Micelijum Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kora gomolja 1 | 50 | 32 | + |
Kora gomolja 2 | 50 | 30 | + |
Kora gomolja 3 | 50 | 31.5 | + |
list krompira | 50 | 29.5 | + |
Bilješka. *U mješavini PCR proizvoda.
Specifičnost test sistema ispitana je na uzorcima DNK ekstrahovanim iz 15 vrsta gljiva. Sve sojeve gljivica autori su izolovali iz obolelih i zdravih plodova i listova paradajza i gomolja krompira; jedan soj je izolovan iz korena pšenice (tabela 1). Među izolovanim sa površine ploda postoje i vrste koje su nepatogene za paradajz (npr. Phellinus ferrugineovelutinus).
Istraživanja su pokazala da je DNK C. coccodes detektovan u ciklusu praga od 20-27, dok druge vrste gljiva nisu detektovane niti su dale signal nakon ciklusa 40, što se može pripisati nespecifičnom efektu buke (Tabela 3).
Tabela 3. Testiranje sistema na različitim vrstama gljiva
Naziv gljive | Ciklus praga |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokodovi 2 | 22.6 |
C. kokodovi 3 | 23 |
C. kokodovi 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium NS. | > 40 |
Bilješka. *Količina DNK u svim uzorcima bila je 10 ng.
Razvijeni test sistem je korišten za identifikaciju C. kokoda u uzorcima listova paradajza sa simptomima oštećenja nekrotrofnim patogenima i krtola sjemenskog krompira bez vidljivih simptoma. Za istraživanje su uzeti sjemenski gomolji različitih sorti uzgojenih u regijama Kostroma, Moskva, Kaluga i Nižnji Novgorod. Prisustvo DNK C. coccodes smatralo se pouzdanim u uzorcima u kojima ciklus praga nije prelazio 35. Ova granična vrijednost je odabrana na osnovu pouzdane detekcije 0.05 ng DNK C. coccodes (granični ciklus 33.5, Tabela 2) i činjenica da je kod praga ciklusa iznad 40 dijagnosticirana nespecifična DNK neke druge vrste gljivica. Ovim pristupom, pouzdano prisustvo DNK C. coccodes otkriveno je u 5 uzoraka gomolja uzgojenih u Kostromskoj, Moskovskoj, Kaluškoj oblasti i u jednom listu paradajza iz okruga Jeisk Krasnodarske teritorije (Tabele 4, 5).
Tabela 4. Detekcija kokoda Colletotrichum na gomoljima krompira*
Broj uzorka | Sorta krompira | Mesto rasta | Detekcija C. kokoda | Ciklus praga |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | Kostroma region | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Područje Moskve | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky early | Područje Moskve | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Moli | Regija Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantazija | Regija Kaluga | - | |
15 | Gala | Nižnji Novgorod regija. | - | |
16 | - |
Bilješka. *Količina DNK u svim uzorcima bila je 50 ng.
Tabela 5. Detekcija Colletotrichum coccodes na listovima paradajza*
Broj uzorka | Mesto rasta | Detekcija C. kokoda | Ciklus praga |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarski kraj, okrug Krim | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarski kraj, okrug Jeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*Količina DNK u svim uzorcima bila je 50 ng.
Test sistem koji smo kreirali nije inferioran u odnosu na onaj koji su razvili engleski istraživači (Cullen et al., 2002) po osjetljivosti i specifičnosti i pogodan je za analizu biljnih uzoraka. Njegova upotreba za analizu sjemenskih gomolja omogućila je detekciju DNK C. coccodes u gomoljima bez vanjskih znakova oštećenja i uspješnu analizu infekcije listova.
U Rusiji, do danas, gomolji krompira nisu analizirani na infekciju C. coccodes. Naše prvo istraživanje je pokazalo da od 16 testiranih sjemenskih gomolja uzgojenih u različitim regijama Ruske Federacije, 5 sadrži C. coccodes. To pokazuje da je crna pjegavost gomolja krompira česta bolest krompira u Rusiji, a njena uloga u smanjenju obima i kvaliteta usjeva krompira je potcijenjena.
Prilikom analize listova paradajza, pouzdano prisustvo DNK C. coccodes otkriveno je u jednom listu iz okruga Yeisk Krasnodarske teritorije. Ranije, pri ispitivanju polja paradajza u južnoj Rusiji pomoću britanskog test sistema (Cullen et al., 2002), identifikovani su listovi koji sadrže C. coccodes, a na nekim poljima je utvrđen visok udio listova zahvaćenih C. coccodes (Belov et al. al., 2018). U Krasnodarskom i Primorskom području i Moskovskoj regiji otkrili smo plodove paradajza iz kojih smo uspjeli izolirati čiste kulture C. coccodes. Moguće je da je C. coccodes mnogo više rasprostranjen na paradajzu u Rusiji nego što se trenutno vjeruje, a podcjenjuje se i njegova štetnost.
Dakle, do danas je prikupljeno dovoljno informacija o širokoj rasprostranjenosti C. kokoda na krompiru i paradajzu.
Za bolje razumijevanje uloge ove gljive u nastanku bolesti krompira i paradajza potrebno je opsežno praćenje njene rasprostranjenosti u Rusiji, proučavanje uloge zaraza tla i sjemena, te uloge crne mrlje u gubicima skladištenja. Upotreba PCR dijagnostike može značajno olakšati ovaj posao, a istovremena upotreba oba test sistema značajno će povećati tačnost analize.
Rad je podržan grantom Ruske naučne fondacije br. 18-76-00009.
Članak je objavljen u časopisu “Mikologija i fitopatologija” (Vol. 54, br. 1, 2020.).