“Metod uređivanja genoma ne bi trebao biti suprotstavljen tradicionalnim metodama selekcije. “Ovo je prilično nov alat”, naglašava šef laboratorije za otpornost biljaka na stres Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju (VNIISB) Vasilij Taranov. – Nekada su hirurzi radili operacije nožem, pa su se pojavile skalpelima, zatim laserima. Za operaciju su postale dostupne potpuno različite opcije. Dakle, genetski inženjering nudi alat kojim možete uzeti i poboljšati nešto, ali ne poništava niti zamjenjuje sve što je ranije korišteno.”
Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju (VNIISB) vodi laboratoriju za otpornost biljaka na stres, čiji se rad odvija u dva glavna smjera: potraga za genima koji određuju otpornost biljaka na abiotički i biotički stres i uređivanje genoma kultiviranih biljaka kako bi se povećala njihova otpornost na stres. Područje istraživanja naučnika uključuje krompir i povrće na otvorenom.
O tome koje su karakteristike i prednosti najnovijih tehnologija, koje rezultate mogu postići i koje probleme ruskih poljoprivrednih proizvođača koriste laboratorijski naučnici, razgovaramo sa šefom laboratorije Vasilijem Taranovim i višim istraživačem Marinom Lebedevom.
– Danas se mnogo govori o potrebi da se ubrza proces selekcije. Vjeruje se da metoda uređivanja genoma to omogućava. Istina je?
V.T.: Ispravnije bi bilo reći da biotehnološke metode pomažu ne toliko da se ubrza selekcija, koliko da se prošire mogućnosti naučnika. Proces rada na sorti i dalje ostaje prilično dugotrajan, budući da je riječ o biljkama koje imaju određeni životni ciklus.
Ali postaje moguće da stručnjaci dobiju rezultate koje bi bilo izuzetno teško (ako ne i nemoguće) postići korištenjem tradicionalnih metoda uzgoja.
Uz pomoć genomskog uređivanja možemo namjerno uvesti mutaciju koja direktno utječe na specifičnu karakteristiku sorte, a da ostatak kompleksa ekonomski vrijednih osobina zadrži nepromijenjenim.
M.L.: Zamislite da želimo da uvedemo gen otpornosti iz divljeg krompira u našu kultivisanu sortu koristeći tradicionalne metode uzgoja. Da bi to učinio, uzgajivač provodi seriju križanja "divljaka" s određenim kulturnim linijama. Problem je što se uz gen otpornosti na sortu prenose i svi ostali „divlji“ geni, što je najčešće krajnje nepoželjno. Genetski inženjering vam omogućava da uzmete/promenite samo jedan željeni gen.
– Postoji stanovište da uprkos činjenici da je metoda uređivanja genoma poznata već 10-ak godina, ona još nije dala zapažene komercijalne rezultate.
V.T.: Ovo nije sasvim tačno. Vodeće svjetske kompanije za uzgoj koriste uređivanje genoma i to ne kriju. Ali ne znamo šta tačno rade i kakve rezultate dobijaju.
Dostignuća se ne reklamiraju jer je skuplje iznijeti na tržište biljku koja je obrađena metodama genetskog inženjeringa od one koja je dobijena tradicionalno. A ponekad je to jednostavno nemoguće učiniti.
U isto vrijeme, vrlo je teško dokazati da je uređivanje genoma korišteno za stvaranje određene sorte korištenjem postojećih metoda.
Tokom testa, stručnjaci će tražiti sekvencu markera u genomu organizma, a ako je prisutna, biljka će biti prepoznata kao genetski modificirana. Ali kod genomskog uređivanja ništa se ne unosi u genom, tako da se ništa ne može pronaći.
Promjene često utiču ne samo na jedan gen, već na određeno mjesto u genu, doslovno jedan nukleotid, jedno slovo. A preostale milijarde pisama ostaju onakve kakve su bile. Da biste utvrdili da je biljka uređena, trebate zapravo pročitati cijeli njen genom, s pokrivenošću deset puta većom od standardne kako biste eliminirali grešku. Niko neće raditi tako obimnu i vrlo skupu analizu, a uzgajivač uvijek može reći da je biljku dobio mutagenezom ili tradicionalnom selekcijom.
– M.L.: Uređivanje genoma općenito, a posebno iskustvo korištenja ovih tehnologija na biljkama, prilično je novija priča.
Ne samo zato što da biste promijenili funkciju morate znati šta tačno i kako da je uredite. Biljne osobine određuju geni, najčešće skup gena, od kojih se moraju odabrati pogodne mete za uređivanje. Ali razjašnjavanje funkcija i regulacije specifičnih gena koji doprinose osobinama od interesa zahtijeva složena i često dugotrajna istraživanja. U poređenju sa životinjama i ljudima, možemo reći da mnoge molekularne mehanizme biljnih svojstava (npr. otpornost, produktivnost itd.) ne poznajemo baš dobro. Istovremeno, biljni genomi su veći i složeniji, što nimalo ne pojednostavljuje zadatak. Međutim, mnogo je već poznato kroz osnovna istraživanja u biljnoj biologiji, i što više to razumijemo, naše mogućnosti za modifikaciju se povećavaju.
Osim toga, riječ je o metodi koja omogućava ispravljanje određenih karakteristika, ali ne i uvođenje novih sorti na tržište, a rad na kojem, unatoč određenom ubrzanju, i dalje traje godinama.
– Da li se biotehnolozi bave uređivanjem gena? Kako određuju stvarni pravac rada (svrha uređivanja)?
V.T.: Biotehnolog mora raditi u tandemu s uspješnim uzgajivačem odabrane kulture i, u idealnom slučaju, uključiti druge specijalizirane proizvođače. Uzgajivač, zajedno sa farmerima, postavlja zadatak, uzgajivač pomaže u odabiru odgovarajućih genotipova. Mi se pak konsultujemo sa biohemičarima i genetičarima, razmišljamo šta možemo da ponudimo na osnovu toga (potrebne karakteristike nisu uvek dovoljno proučene sa biološke tačke gledišta). Gledamo šta zapravo možemo da uradimo, izvršimo svoju fazu posla, vratimo rezultujuću liniju oplemenjivaču, a oplemenjivač donosi rezultat sorti.
- Da li je uređivanje genoma skupa tehnologija?
V.T.: Cijena nabavke biljke ovisi o usjevu i da li je rezultirajuća biljka uređena ili transgena.
Ako govorimo o opremi, onda će za kompaniju koja se već bavi nabavkom materijala bez virusa i mikrokloniranjem, kupnja opreme i reagensa za uređivanje genoma koštati relativno mali iznos. Prepreka započinjanju takvog posla možda nije preveliki iznos ulaganja, već nedostatak kvalifikovanog osoblja. Vrlo je malo ljudi koji mogu preuzeti i obaviti takav specijalizirani zadatak.
I da se vratimo na troškove: tehnološki napredak u ovoj oblasti je veoma brz. Metode uređivanja genoma, recimo, 2012. godine, kada je otkriven CRISPR/Cas9 (tehnologija za uređivanje genoma viših organizama, zasnovana na imunološkom sistemu bakterija), i ono što imamo sada su veoma različite. Operativna efikasnost raste iz godine u godinu, a troškovi se smanjuju.
M.L.: Ovo se može uporediti sa projektom sekvenciranja ljudskog genoma. Prvi ljudski genom sekvencirao je međunarodni konzorcij 10 godina za 2.7 milijardi dolara samo zato što su takve tehnologije bile dostupne 90-ih godina. Trenutno, sekvenciranje kompletnog ljudskog genoma košta manje od 1000 dolara i traje nekoliko dana.
– Pređimo na razgovor o vašoj laboratoriji, da li je fokusirana na fundamentalnu nauku ili primijenjena istraživanja?
V.T.: Trudimo se da uradimo oboje. Prvobitno je prioritet davan osnovnim stvarima, ali sada pokušavamo da svoje razvoje primenimo u praksi.
Trenutno, na primjer, proučavamo mehanizme otpornosti krompira na virus Y. Ovo je mnogo fundamentalnog rada, ali ako bude uspješan, rezultat će biti vrlo zanimljiv za selekciju otpornih sorti.
M.L.: Fundamentalna i primijenjena nauka su međusobno usko povezane; jedna bez druge ne može postojati. Ako ne znamo kako virus stupa u interakciju s biljkom, sa kojim specifičnim proteinima, nećemo ih moći promijeniti kako bismo biljku učinili otpornom.
Istraživanja o virusu Y provodimo od 2018. godine i sada se približavamo činjenici da ćemo u narednih nekoliko godina dobiti formulu za otpornost, a u budućnosti i neophodan praktični rezultat: biljka krompira neće sintetizirati virusne proteine, već će biti otporan na virus.
– Da li sarađujete sa ruskim odgajivačima/uzgajivačima?
V.T.: Na krumpiru radimo s mladom uzgajivačem Marijom Poljakovom, aktivno komuniciramo sa stručnjacima iz Unije krumpira i održavamo kontakte sa Saveznim istraživačkim centrom za krumpir po imenu. A.G. Lorja. Što se tiče kupusa, sarađujemo sa uzgajivačima i uzgajivačima sjemena Ruskog državnog agrarnog univerziteta-Moskovske poljoprivredne akademije po imenu. K.A. Timirjazev od Grigorija i Sokrata Monahosa. A u onome što radimo u ovoj oblasti, u potpunosti smo vođeni njima.
– I opet o virusima. Marina Valerievna, vaša naučna interesovanja ne uključuje samo virus Y. Godine 2023. dobili ste grant od Ruske naučne fondacije za sprovođenje istraživanja na projektu „Proučavanje viroma kultivisanog krompira (Solanum tuberosum L.) korišćenjem metoda sekvencioniranja visoke propusnosti“. Zašto je ova tema interesantna?
M.L.: Krompir, u većoj mjeri od mnogih drugih biljaka, pati od virusnih bolesti, jer se razmnožava vegetativno. Virusi se akumuliraju u gomoljima i prenose na sljedeće generacije, pa virusno opterećenje stalno raste. Kada kažu da se krompir degeneriše, upravo o tome govorimo.
Virusi nisu inertni sistemi; oni aktivno stupaju u interakciju i sa biljkom domaćinom i jedni s drugima. Postoje slučajevi kada biljka koja je već bolesna od jednog specifičnog virusa ne može da se zarazi drugim. A postoje virusi koji ne mogu zaraziti biljku sami, djeluju samo u suradnji s drugim virusima. Nedavno je objavljen rad koji opisuje oblike virusa koji pomažu biljkama da prežive sušu. Tako neočekivani prijelaz iz parazitizma u mutualizam.
Ne postoje efikasne hemikalije za borbu protiv virusnih bolesti na krompiru. Za poboljšanje njegovog zdravlja razvijene su prilično složene i, što je najvažnije, skupe metode: kroz in vitro kulturu, dobijanje mikrotubera. Ali rezultat traje samo nekoliko generacija. Da biste pronašli druga rješenja, potrebno je detaljnije proučiti karakteristike virusa, tako da je studija vrlo, vrlo relevantna.
– GOST 33996-2016 „Sjemenski krompir. Tehnički uslovi i metode za određivanje kvaliteta" navodi se pet virusa (PVK - X virus krompira; SBK - S virus krompira; MVK - M virus krompira; YBK - Y virus krompira; VSLK - virus uvijanja listova krompir) i jedan viroid (PSTV – viroid vretena krompira). Hoćete li se fokusirati na njih?
M.L.: Moj projekat ima za cilj korištenje metoda visoke propusnosti za proučavanje onih viroma (zbirki virusa) koji su prisutni na krumpiru u Rusiji. Ovo je zanimljivo kako sa stanovišta toga koji se kompleksi različitih virusa nalaze na jednoj biljci, tako i sa stanovišta prevalencije ovih virusa.
Ukupno je u svijetu poznato više od 50 virusa koji se nalaze na krumpiru. One navedene u GOST-u su među najopasnijima, a osim toga imaju jasne vanjske znakove. Dakle, mozaična nekroza je uobičajena manifestacija infekcije virusom Y, a prisustvo virusa uvijanja lista može se utvrditi karakterističnom deformacijom listova listova.
No, postoji mnogo virusa koji se ne manifestiraju fenotipski, iako mogu utjecati i na usjeve. Rijetko se otkrivaju, ali samo zato što se ne traže.
Kao primjer mogu navesti rad kolega sa Sveruskog istraživačkog instituta za zaštitu bilja (VIZR). 2019. godine objavili su članak o otkriću virusa krompira P u Rusiji. Ranije se vjerovalo da se distribuira isključivo u Južnoj Americi.
Pitanje je šta ćemo otkriti ako ne pogledamo „ispod ulične lampe“ gde je svetlo, već tamo gde još nismo pogledali.
– Gdje ćete provoditi svoje istraživanje?
M.L.: Prema uslovima granta, projekat će trajati dvije godine. Prošle godine smo sarađivali sa farmom krompira u regionu Tula, sakupljali materijal, radili sa različitim sortama i reprodukcijama. Ove godine ćemo ići u druge regije i vidjeti koji se virusi tamo nalaze.
Rezultati studije bit će sumirani 2025. godine, a o njima ćemo svakako reći ruskim uzgajivačima krumpira.