S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Dyakov
Uvod
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary, uzročnik kasne bolesti, ekonomski najvažnije bolesti krompira i paradajza, privlači pažnju istraživača iz različitih zemalja više od jednog i po veka. Iznenada se pojavio u Evropi sredinom XNUMX. vijeka i izazvao epidemiju krumpira koja je ostala u sjećanju mnogih generacija.
Do sada se često naziva "gljivom irske gladi". Gotovo stotinu godina nakon prvih epidemija otkrivene su divlje meksičke vrste krumpira otporne na kasnu plamenjaču, razvijene su metode ukrštanja s uzgajanim krumpirom (Muller, 1935) i dobivene su prve sorte otporne na kasnu plamenjaču (Pushkarev, 1937). Međutim, ubrzo nakon početka njihovog komercijalnog uzgoja, akumulirale su se rase patogena kasne bolesti koji su bili virulentni prema rezistentnim sortama. i uvođenje novih gena otpornosti divljeg meksičkog krompira u sorte počelo je brzo gubiti efikasnost.
Neuspjesi u primjeni monogenog (vertikalnog) otpora natjerali su uzgajivače da traže složenije načine iskorištavanja nespecifične poligenske (horizontalne) rezistencije. Posljednjih godina u pojedinim populacijama parazita počele su se gomilati vrlo agresivne rase, što je uzrokovalo eroziju čak i nespecifične rezistencije. Pojava sojeva otpornih na fungicide izazvala je probleme u upotrebi hemikalija za zaštitu krompira.
Zbog značajnih razlika između oomiceta i gljivica u hemijskom sastavu, ultrastrukturi i metabolizmu, fungicidi, posebno sistemski, koji se koriste za zaštitu biljaka od mnogih gljivičnih bolesti, su neučinkoviti protiv oomiceta.
Stoga je u hemijskoj zaštiti od kasne bolesti korišteno višestruko (do 12 puta u sezoni ili više) prskanje kontaktnim preparatima širokog spektra djelovanja. Revolucionarni korak bila je upotreba fenilamida koji su toksični za oomicete i sistemski se šire u biljkama. Međutim, njihova široka upotreba brzo je dovela do nakupljanja rezistentnih sojeva u populacijama gljiva (Davidse i sur., 1981), što je značajno zakompliciralo zaštitu biljaka. P. infestans je praktički jedini parazit umjerenog pojasa, čija se šteta u organskom uzgoju ne može neutralizirati bez upotrebe hemijskih sredstava zaštite (Van Bruggen, 1995).
Navedeno objašnjava ogromnu pažnju koju su istraživači iz različitih zemalja posvetili proučavanju populacija P. infestans, dinamici njihovog obilja i genetskom sastavu, kao i genetskim mehanizmima varijabilnosti.
Životni ciklus R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans razvija međućelijski micelij s haustorijom unutar lišća krompira. Hraneći se tkivima lišća, uzrokuje stvaranje tamnih mrlja koje po vlažnom vremenu postaju crne i trule. Snažnim porazom cijeli list umire. Nakon perioda hranjenja, na miceliju nastaju izdanci - sporangiofori - koji rastu prema van kroz stomate. Za vlažnog vremena stvaraju bijeli procvat oko mjesta na donjoj strani lišća. Na krajevima sporangiofora nastaju zoosporangije u obliku limuna, koje se prekidaju i prenose prskanjem kiše (slika 1). Padajući u kapljice vode na površinu lista krompira, sporangije klijaju sa 6-8 zoospora, koje se nakon perioda kretanja zaobljuju, prekrivaju ljuskom i klijaju cijevi klice. Klica prodire kroz stomate u tkivo lista. Pod određenim uvjetima, sporangije mogu rasti u cijevi za rast direktno u tkivo lišća. Pod povoljnim uvjetima, vrijeme od infekcije do stvaranja nove sporulacije je samo 3-4 dana.
Jednom na tlu i filtrirani kroz tlo, sporangije su sposobne zaraziti gomolje. Jako zahvaćeni gomolji trunu tokom skladištenja; kod slabo pogođenih infekcija može potrajati do sljedeće sezone. Uz to, uzročnici kasne bolesti mogu se zadržati zimi u obliku oospora (polnih spora debelih zidova) u tlu na biljnim ostacima i na sjemenkama paradajza. Oospore nastaju na živim organima biljaka kada se sojevi različitih vrsta parenja susretnu s prekomjernom vlagom. U proljeće se na zasađenim zaraženim gomoljima i na biljnim ostacima s oosporama stvara nespolna sporulacija; zoospore ulaze u tlo i uzrokuju infekciju donjeg lišća biljaka. U nekim slučajevima micelij može rasti iz zaražene gomolje duž zelenog dijela biljke i obično se pojavljuje u gornjem dijelu stabljike.
Značajna razlika između oomiceta i većine gljivica leži u prevladavanju diplofaze u njihovom životnom ciklusu sa gametskom mejozom i klijanjem zigota (oospora) bez reduktivne nuklearne fisije. Čini se da ova karakteristika, plus dipolarni heterotalizam koji zamjenjuje biseksualnost, omogućava primjenu na oomicete pristupa razvijenih za proučavanje populacija viših eukariota (analiza panmiksije i podjele populacija, unutar- i interpopulacijski tokovi gena, itd.). Međutim, tri faktora ne omogućavaju potpuno prenošenje ovih pristupa u proučavanju populacija P. infestans.
1. Uz hibridne oospore, u populacijama se formiraju samoplodne i partenogenetske oospore (Fife i Shaw, 1992; Anikina i sur., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), a učestalost njihovog nastanka može biti dovoljna da utiče na rezultatima ispitivanja.
2. Spolni proces u P. infestans daje beznačajan doprinos dinamici veličine populacije, jer se gljiva razmnožava uglavnom vegetativnim sporama, čineći za više od 90% rezultata analize tipa parenja tradicionalnom metodom na hranjivoj podlozi. ... sezona rasta je nekoliko generacija aseksualne sporulacije (razvoj policikličke bolesti). Oospore imaju važnu ulogu u očuvanju organizma u periodu kada nema zelenih biljaka (zimi) i u primarnoj zarazi sadnica. Zatim, tokom ljeta dolazi do klonske reprodukcije i povećanja ili, obratno, smanjenja broja pojedinačnih klonova koji nastaju kao rezultat seksualne rekombinacije, što se uglavnom određuje odabirom prilagođenijih. Prema tome, omjer pojedinačnih klonova u populaciji na početku i na kraju epifitotika može biti potpuno različit.
3. Opisani ciklus karakterističan je za domaće populacije P. infestans u njihovoj domovini, Srednjoj Americi. U drugim dijelovima svijeta seksualni proces nije bio poznat više od 100 godina; vegetativni micelij u zaraženim gomoljima krompira bio je faza zimovanja. Životni ciklus bio je potpuno agamičan, a širenje je imalo žarišnu prirodu: infekcija iz pojedinačno zaraženih posađenih gomolja prelazila je u lišće, formirajući primarna žarišta bolesti, koja bi se mogla stopiti s masovnim razvojem bolesti.
Dakle, u nekim regijama može doći do izmjene seksualnih i aseksualnih ciklusa, dok u drugima - samo aseksualnih.
Porijeklo P. INFESTANS
P. infestans pojavili su se u Evropi krajem prve polovine 1991. vijeka. Budući da je krompir porijeklom sa sjeveroistoka Južne Amerike, pretpostavljalo se da je parazit odatle dopremljen u Europu tijekom procvata čileanske šalitre. Međutim, studije provedene na stanici za krompir Rockefeller Center u dolini Toluca u Meksiku prisilile su na ponovno razmatranje ovog gledišta (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. U dolini Toluke lokalne gomoljaste vrste krompira (Solanum demissum, S. bulbocastanum, itd.) Imaju različite setove gena za vertikalnu rezistenciju u kombinaciji s visokim nivoom nespecifične rezistencije, što ukazuje na dugu koevoluciju s parazitom. Južnoameričkim vrstama, uključujući usjev krompir, nedostaju geni otpornosti.
2. U dolini Toluce postoje izolati s tipovima parenja A1 i A2, što je rezultiralo rasprostranjenošću križane populacije P. infestans; dok se u matičnoj zemlji uzgajanog krompira, Južnoj Americi, parazit širi klonski.
3. U dolini Toluce postoje godišnje ozbiljne epidemije kasne bolesti. Stoga je među sjevernoameričkim istraživačima (Univerzitet Cornell) utvrđeno mišljenje o Mesoamerici (Srednja Amerika) kao rodnom mjestu fitoftore krompira (Goodwin i sur., 1994).
Južnoamerički istraživači ne dijele ovo mišljenje. Oni vjeruju da uzgajani krompir i njegov parazit P. infestans imaju zajedničku domovinu - Južnoameričke Ande. Podržali su svoje stanovište molekularnim studijama o analizi DNK polimorfizama mitohondrijskog genoma (mtDNA) i nuklearnih gena RAS i β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Pokazali su da sojevi prikupljeni iz različitih dijelova svijeta potječu od tri različite linije predaka koje (sve tri) postoje u južnoameričkim Andama. Andski haplotipovi su potomci dviju linija: izolati najstarije loze mtDNA nalaze se na divljim Solanaceae iz odjeljka Anarrhicomenum u Ekvadoru, dok su izolati druge linije uobičajeni na krumpiru, paradajzu i divljim noćuracima. U Toluci, čak i rijetki haplotipovi potječu iz samo jedne loze, a genetska varijabilnost sojeva Toluca (mala alelna učestalost nekih varijabilnih mjesta) ukazuje na snažni efekt osnivača zbog nedavnog zanošenja.
Pored toga, u Andama je pronađena nova vrsta P. andina, morfološki i genetski slična P. infestans, koja, prema autorima, ukazuje na Ande kao žarište specijacije u rodu Phytophthora. Konačno, u Europi i Sjedinjenim Državama populacije P. infestans uključuju obje andske loze, dok u Toluci samo jedna.
Ova publikacija potaknula je odgovor grupe istraživača iz različitih zemalja, koji su radili puno eksperimentalnih radova na reviziji prethodno izvedene studije (Goss i sar., 2014). U ovom radu, prvo, korišćene su informativnije mikrosatelitske sekvence DNK za proučavanje DNK polimorfizama; drugo, za analizu klastera, migracionih puteva, vremenskih divergencija populacija itd. korišteni su napredniji modeli (F-statistika, Bayesove aproksimacije, itd.) i, treće, upoređivanje je korišteno ne samo sa andskom vrstom P. andina, u kojoj je uspostavljena hibridna priroda (P. infestans x Phytophthora sp.) ali i sa meksičkim endemskim vrstama P. mirabilis, P. Ipomoeae i Phytophthora phaseoli, koje su genetski bliske P. infestans uključene u istu kladu (Kroon et al., 2012). Kao rezultat ovih analiza nedvosmisleno je pokazano da korijenski dio filogenetskog stabla svih vrsta roda Phytophthora uzetih u istraživanje, osim hibrida P. andina, pripada meksičkim sojevima, a tok migracije ima smjer Meksiko - Ande, a ne obrnuto, a njegov se početak poklapa s europskim kolonizacija Novog svijeta (prije 300-600 godina). Dakle, pojava vrste P. infestans specijalizovane za poraz krompira dogodila se u sekundarnom genetskom centru formiranja gomoljastih solanaceous biljaka, tj. u Centralnoj Americi.
Genom P. INFESTANS
2009. godine međunarodni tim naučnika sekvencirao je kompletan genom P infestansa (Haas et al, 2009), čija je veličina bila 240 MB. To je nekoliko puta više nego kod usko povezanih vrsta P. sojae (95 Mb), koje uzrokuju truljenje korijena soje, i P. Ramorum (65 Mb), koji utječu na takve vrijedne vrste drveća kao što su hrast, bukva i neke druge. Dobijeni podaci su pokazali da genom sadrži veliki broj kopija ponovljenih sekvenci - 74%. Genom sadrži 17797 gena koji kodiraju proteine, od kojih su većina geni uključeni u stanične procese, uključujući replikaciju DNK, transkripciju i translaciju proteina.
Usporedbom genoma roda Phytophthora otkrivena je neobična organizacija genoma, koja se sastoji od blokova sekvenci konzerviranih gena, u kojima je gustina gena relativno visoka, a sadržaj ponovljenih sekvenci relativno nizak, te pojedinačnih regija s nesačuvanim genskim sekvencama, s niskom gustinom gena i velikim sadržajem regija koje se ponavljaju. Konzervativni blokovi čine 70% (12440) svih gena koji kodiraju proteine P. infestans. Unutar konzervativnih blokova geni su obično usko udaljeni, sa prosječnom međugene udaljenostom od 604 bp. U područjima između konzervativnih blokova, međugena udaljenost je veća (3700 bp) zbog povećanja gustoće ponavljajućih elemenata. Geni za izlučivanje efektora koji se brzo razvijaju nalaze se u regijama siromašnim genima.
Analiza sekvence genoma P. Infestans pokazala je da otprilike trećina genoma pripada prenosivim elementima. Genom P. infestans sadrži znatno više različitih porodica transpozona od ostalih poznatih genoma. Većina transpozona P. infestans pripadaju ciganskoj porodici.
U genomu P. infestans identificiran je veliki broj specifičnih porodica gena uključenih u patogenezu. Značajan dio njih kodira efektorske proteine koji mijenjaju fiziologiju biljke domaćina i doprinose njenoj infekciji. Pripadaju dvjema širokim kategorijama: apoplastični efektori koji djeluju u međućelijskim prostorima (apoplasti) i citoplazmatski efektori koji ulaze u stanice putem haustorije. Apoplastični efektori uključuju izlučene hidrolitičke enzime kao što su proteaze, lipaze i glikozilaze koji uništavaju biljne ćelije; inhibitori obrambenih enzima biljaka domaćina i nekrotizirajući toksini kao što su proteini slični Nep1 (NPL) i mali proteini bogati cisteinom slični Pcf (SCR).
Učinkoviti geni P. infestans su brojni i obično su veći od nepatogenih gena. Najpoznatiji su citoplazmatski efektori RXLR i Crinkler (CNR). Tipični citoplazmatski efektori oomiceta su RXLR proteini. Svi do sada otkriveni efektorski geni RXLR sadrže amino-terminalnu skupinu Arg-XLeu-Arg, gdje je X aminokiselina. Kao rezultat studije, sugerirano je da u genomu P. infestans postoje 563 RXLR gena, što je 60% više u odnosu na P. sojae i P. ramorum. Približno polovina RXLR gena u genomu P. infestans specifična je za vrstu. RXLR efektori imaju širok spektar sekvenci. Među njima je identificirana jedna velika i 150 malih porodica. Za razliku od glavnog proteoma, efektorski geni RXLR obično su smješteni u regijama genoma siromašnih i ponovljenim obiljem. Mobilni elementi koji određuju dinamičnost ovih regija olakšavaju rekombinaciju ovih gena.
Citoplazmatski CRN efektori prvobitno su identificirani u transkriptima P. infestans koji kodiraju peptide nekroze biljnog tkiva. Od njihovog otkrića malo se zna o porodici ovih efektora. Analizom genoma P. Infestans otkrivena je ogromna porodica od 196 CRN gena, što je znatno veće nego kod P. sojae (100 CRN) i P. ramorum (19 CRN). Poput RXLR-a, CRN-ovi su modularni proteini i sastoje se od visoko konzervirane N-terminalne LFLAK domene (50 aminokiselina) i susjedne DWL domene koja sadrži različite gene. Većina CRN-ova (60%) posjeduje signalni peptid.
Proučavana je mogućnost različitih CRN-ova da poremete stanične procese biljke domaćina. Analizom biljne nekroze, uklanjanjem proteina CRN2 omogućeno je identificiranje C-terminalne regije koja se sastoji od 234 aminokiseline (položaji 173-407, DXG domena) i uzrokuje staničnu smrt. Analiza CRN gena P. infestans otkrila je četiri različita C-terminalna područja, koja takođe uzrokuju staničnu smrt unutar biljke. Tu spadaju novoidentificirani DC domeni (P. Infestans ima 18 gena i 49 pseudogena), kao i D2 (14 i 43) i DBF (2 i 1) domeni koji su slični protein kinazama. Proteini CRN domena eksprimirani u biljci čuvaju se (u odsustvu signalnih peptida) u biljnoj ćeliji i stimuliraju staničnu smrt unutarćelijskim mehanizmom. Još 255 sekvenci koje sadrže CRN domene najvjerovatnije ne funkcioniraju kao geni.
Povećanje broja i veličine porodica efektorskih gena RXLR i CRN vjerovatno je posljedica nealelne homologne rekombinacije i umnožavanja gena. Uprkos činjenici da genom sadrži veliki broj aktivnih pokretnih elemenata, još uvijek nema direktnih dokaza o prijenosu efektorskih gena.
Metode korištene u proučavanju strukture stanovništva
Proučavanje genetske strukture populacija trenutno se temelji na analizi čistih kultura njegovih sastavnih sojeva. Analiza populacija bez izoliranja čistih kultura također se provodi u posebne svrhe, kao što je, na primjer, proučavanje agresivnosti populacije ili prisustvo sojeva otpornih na fungicide u njoj (Filippov i sur., 2004; Derevyagina i sur., 1999). Ova vrsta istraživanja uključuje upotrebu posebnih metoda, čiji opis prelazi opseg ovog pregleda. Za komparativnu analizu sojeva koriste se brojne metode zasnovane kako na analizi strukture DNK tako i na proučavanju fenotipskih manifestacija. Uporedna analiza populacija mora se baviti velikim brojem izolata, što nameće određene zahteve korišćenim metodama. U idealnom slučaju, trebali bi ispuniti sljedeće zahtjeve (Cooke, Lees, 2004., Mueller, Wolfenbarger, 1999.):
- biti jeftini, jednostavni za primjenu, ne zahtijevaju značajne vremenske troškove, temeljiti se na općenito dostupnim tehnologijama (na primjer, PCR);
- mora generirati dovoljno velik broj nezavisnih kodominantnih obilježja markera;
- imaju visoku obnovljivost;
- koristiti minimalnu količinu tkiva za ispitivanje;
- biti specifični za supstrat (onečišćenje prisutno u kulturi ne bi trebalo utjecati na rezultate);
- ne zahtevaju upotrebu opasnih postupaka i visoko otrovnih hemikalija.
Nažalost, ne postoje metode koje odgovaraju svim gore navedenim parametrima. Za uporedno proučavanje sojeva u naše vrijeme koriste se metode zasnovane na analizi fenotipskih svojstava: virulencija prema sortama krompira i paradajza (rase krompira i paradajza), vrsta parenja, spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze, te na analizi strukture DNK: polimorfizam dužine restrikcijski fragment (RFLP), koji se obično dopunjuje hibridizacijskom sondom RG 57, analizom mikrosatelitskih ponavljanja (SSR i InterSSR), pojačavanjem slučajnim početnicima (RAPD), pojačavanjem restrikcijskih fragmenata (AFLP), pojačavanjem prajmerima homološnim sekvencama mobilnih elemenata (na primjer, Inter SINE PCR), određivanje haplotipova mitohondrijske DNK.
Kratki opisi metoda uporednog proučavanja sojeva korištenih u radu s P. Infestansom
Fenotipske osobine markera
Utrke "krumpira"
Trke „krumpira“ su često istraživani i korišteni marker. "Jednostavne" rase krompira imaju jedan gen za virulenciju krompira, a "složene" - najmanje dva. Black i suradnici (1953.), sažimajući sve podatke koji su im dostupni, otkrili su da je rasa fitoftora sposobna zaraziti biljke genima / genima otpornosti koji odgovaraju genima / genima virulencije P. infestans i pronašli rase 1, 2, 3 i 4 koje zaraze biljke s genima R1, R2, R3, odnosno R4, tj. interakcija između parazita i domaćina odvija se prema principu gena za gen. Dalje, Black je, uz učešće Galleglyja i Malcolmsona, otkrio gene otpornosti R5, R6, R7, R8, R9, R10 i R11, kao i odgovarajuće rase (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Postoji opsežna baza podataka o rasnom sastavu patogena iz različitih regija. Bez detaljne analize ovih podataka, ukazat ćemo samo na općeniti trend: tamo gdje su korištene sorte s novim genima otpornosti ili njihovim kombinacijama, u početku je došlo do nekog slabljenja pojave kasne bolesti, ali potom su se pojavile i odabrane su rase s odgovarajućim genima virulencije te su nastali napadi kasne bolesti. Specifična virulencija prema prva 4 gena rezistencije (R1-R4) rijetko je primijećena u kolekcijama prikupljenim prije uvođenja u uzgoj sorti s tim genima, ali se broj virulentnih sojeva naglo povećao kada je patogen parazitirao na sortama koje nose te gene. S druge strane, geni 5-11 bili su prilično česti u kolekcijama (Shaw, 1991).
Studija o omjeru različitih rasa tijekom vegetacije, provedena krajem 1980-ih, pokazala je da na početku razvoja bolesti u populaciji prevladavaju klonovi s niskom agresivnošću i 1-2 virulentna gena.
Dalje, razvojem kasne bolesti, koncentracija izvornih klonova opada i povećava se broj "složenih" rasa sa visokom agresivnošću. Pojava potonjeg do kraja sezone doseže 100%. Pri skladištenju krtola dolazi do smanjenja agresivnosti i gubitka pojedinačnih gena virulencije. Dinamika zamjene klonova može se pojaviti u različitim sortama na različite načine (Rybakova & Dyakov, 1990). Međutim, naše studije 2000-2010. Pokazale su da su složene rase pronađene od samog početka epifitoze među sojevima izoliranim i od krompira i od paradajza. To je vjerovatno zbog promjena u populaciji P. Infestans u Rusiji.
Do 1988.-1995., Pojava „superrasa“ sa svim ili gotovo svim genima virulencije u različitim regijama dostigla je 70-100%. Ova je situacija zabilježena, na primjer, u Bjelorusiji, u Lenjingradskoj i Moskovskoj regiji, u Sjevernoj Osetiji i u Njemačkoj (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Utrke "paradajz"
U sortama paradajza pronađena su samo 2 gena otpornosti na kasnu mrlju - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) i Ph2 (Al-Kherb, 1988). Kao i u slučaju rasa krumpira, interakcija između paradajza i P. infestans odvija se na osnovu gena po genu. T0 rasa inficira sorte koje nemaju gene otpornosti (većina industrijski korišćenih sorti), T1 rasa inficira sorte sa genom Ph1 (Ottawa), a rasa T2 sorte s genom Ph2.
U Rusiji je na krompiru pronađen gotovo isključivo T0; T0 je na početku sezone dominirao na paradajzu, ali kasnije ga je zamijenila rasa T1 (Dyakov i sur., 1975, 1994). Nakon 2000. godine, T1 na krompiru u mnogim populacijama počeo se javljati na samom početku epifitotskog razdoblja. U Sjedinjenim Državama sojevi krompira nisu bili patogeni za paradajz, kao ni rase T0, T1 i T2, dok su T1 i T2 prevladavali na paradajzu (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin i sur., 1995).
Tip parenja
Za provođenje studije potrebni su ispitivački (referentni) sojevi s poznatim vrstama parenja - A1 i A2. Ispitni izolat inokulira se s njima u parovima u Petrijeve zdjelice s medijem zobenih agara. Nakon 10 dana inkubacije, ploče se ispituju na prisustvo ili odsustvo oospora u medijumu u kontaktnoj zoni sojeva. Postoje 4 mogućnosti: soj pripada tipu A1 parenja, ako tvori oospore s testerom A2, A2, ako tvori oospore s testerom A1, A1A2, ako tvori oospore s oba testa ili je sterilan (00), ako ne tvori oospore bez testera (posljednje dvije grupe su rijetke).
Da bi se brže utvrdile vrste parenja, pokušani su identificirati regije genoma povezane s vrstom parenja, s ciljem daljnjeg korištenja za određivanje vrste parenja pomoću PCR-a. Američki istraživači proveli su jedan od prvih uspješnih eksperimenata za identifikaciju takvog mjesta (Judelson i sur., 1995). Koristeći RAPD metodu, uspjeli su identificirati regiju W16 povezanu s tipom parenja u potomstvu dvaju ukrštenih izolata i dizajnirati par prajmera od 24 bp koji će je pojačati (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') i W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Nakon restrikcije PCR proizvoda restrikcijskim enzimom HaeIII, bilo je moguće razdvojiti izolate sa tipovima uparivanja A1 i A2.
Korejski istraživači poduzeli su još jedan pokušaj dobivanja PCR markera za određivanje vrsta parenja (Kim, Lee, 2002). Identifikovali su određene proizvode pomoću AFLP metode. Kao rezultat toga, razvijen je par početnica PHYB-1 (naprijed) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') i PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), što omogućava selektivno pojačavanje regiona genoma povezanog s tipom parenja A2. Nakon toga nastavili su s ovim radom i dizajnirali početnice 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, naprijed) i 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), omogućavajući selektivno pojačavanje Mat-A1 regije, karakteristično za sojeve s tipom parenja. A1. Upotreba PCR dijagnostike tipova parenja pokazala je dobre rezultate pri proučavanju populacija P. infestans u Češkoj (Mazakova i sur., 2006), Tunisu (Jmour, Hamada, 2006) i drugim regijama. U našoj laboratoriji (Mytsa, Elansky, neobjavljeno) analizirano je 34 soja P. infestans izolovanih iz bolesnih organa krompira i paradajza u različitim regionima Rusije (Kostroma, Rjazanj, Astrahan, Moskovska oblast). Rezultati PCR analize korištenjem specifičnih primera više od 90% podudarali su se s rezultatima analize vrste parenja tradicionalnom metodom na hranjivom mediju.
Tabela 1. Varijabilnost rezistencije unutar klona Sib 1 (Elansky i sur., 2001)
Mjesto uzimanja uzoraka | Broj analiziranih izolata | Broj osjetljivih (S), slabo otpornih (SR) i rezistentnih (R) sojeva, kom (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Grad Jekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsk region | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Otpornost na metalaksil kao marker populacije
Početkom 1980-ih u raznim regijama zabilježeni su snažni napadi kasne bolesti uzrokovane sojevima P. infestans otpornih na metalaksil. Farme krumpira u mnogim zemljama pretrpjele su značajne gubitke (Dowley i O'Sullivan, 1981; Davidse i dr., 1983; Derevyagina, 1991). Od tada se u mnogim zemljama svijeta provodi stalno praćenje pojave sojeva otpornih na fenilamid u populacijama P. infestans. Uz praktičnu procjenu izgleda za upotrebu lijekova koji sadrže fenilamide, izgradnju sistema zaštitnih mjera i predviđanje epifitozija, rezistencija na ove lijekove postala je jedno od obilježja koja se široko koriste za uporednu analizu populacija ovog patogena. Međutim, upotrebu otpornosti na metalaksil u uporednim populacijskim istraživanjima treba provesti uzimajući u obzir činjenicu da: 1 - genetska osnova rezistencije još nije precizno utvrđena, 2 - rezistencija na metalaksil je selektivno ovisna osobina koja se može mijenjati ovisno o upotrebi fenilamida, 3 - različita stepen osetljivosti na sojeve metalaksila unutar jedne klonske linije (tabela 1).
Spektri izozima
Izozimski markeri obično su neovisni o vanjskim uvjetima, pokazuju mendelovsko nasljeđe i kodominantni su, što omogućava razlikovanje homo- i heterozigota. Upotreba proteina kao genskih markera omogućava identificiranje i velikih reorganizacija genetskog materijala, uključujući hromozomske i genomske mutacije, i zamjenu pojedinačnih aminokiselina.
Elektroforetska ispitivanja proteina pokazala su da većina enzima postoji u organizmima u obliku nekoliko frakcija koje se razlikuju u elektroforetskoj pokretljivosti. Te frakcije su rezultat kodiranja više oblika enzima različitim lokusima (izozimima ili izozimima) ili različitim alelima istog lokusa (alozimima ili aloenzimima). Odnosno, izoenzimi su različiti oblici jednog enzima. Različiti oblici imaju istu katalitičku aktivnost, ali se malo razlikuju u zamjenama pojedinih aminokiselina u peptidu i u zaduženom. Takve se razlike otkrivaju tokom elektroforeze.
U proučavanju sojeva P. infestans koriste se spektri izoenzima dva proteina, peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze (ovaj enzim je monomorfan u ruskim populacijama, pa stoga metode njegovog proučavanja nisu predstavljene u ovom radu). Da bi se razdvojili u izoenime u električnom polju, proteinski pripravci izolirani od ispitivanih organizama nanose se na gel pločicu smještenu u električno polje. Brzina difuzije pojedinih proteina u gelu ovisi o naboju i molekularnoj težini, pa se u električnom polju smjesa proteina razdvaja u zasebne frakcije, koje se mogu vizualizirati pomoću posebnih boja.
Ispitivanje izoenzima peptidaze provodi se na celuloznim acetatnim, škrobnim ili poliakrilamidnim gelovima. Najprikladnija je metoda zasnovana na upotrebi celuloznih acetatnih gelova proizvođača Helena Laboratories Inc. Ne zahtijevaju velike količine ispitnih materijala, omogućava se postizanje kontrastnih traka na gelu nakon elektroforeze za oba enzimska lokusa, a njegova primjena ne zahtijeva veliko vrijeme i materijalne troškove (slika 2).
Mali komad micelija se prebaci u mikrocev od 1,5 ml, doda mu se 1-2 kapi destilirane vode. Nakon toga, uzorak se homogenizira (na primjer, električnom bušilicom s plastičnim nastavkom pogodnim za mikrocijev) i taloži 25 sekundi na centrifugi pri 13000 o / min. 8 μl iz svake mikrocevi. supernatant se prenosi na ploču aplikatora.
Celulozni acetatni gel uklanja se iz puferske posude, upija između dva lista filtrirnog papira i postavlja radnim slojem na vrh plastične podloge aplikatora. Otopinu s ploče aplikator prenosi na gel 2-4 puta. Gel se prenosi u komoru za elektroforezu,
Tabela 2. Sastav otopine koja se koristi za bojenje celuloznog acetat gela u analizi izoenzima peptidaze, kap boje (bromfenolsko plava) stavi se na rub gela.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidaza, 1000 U / ml 5 kapi
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 kapi
MgCl2, 20 mg / ml 2 kapi
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kapi
L-aminokiselinska oksidaza, 20 u / ml 2 kapi
Elektroforeza se provodi 20 minuta. na 200 V. Nakon elektroforeze, gel se prebacuje na sto za slikanje i oslikava posebnim rastvorom za bojanje (tabela 2). 10 ml 1,6% DIFCO agara prethodno se otopi u mikrotalasnoj pećnici, ohladi na 60 ° C, nakon čega se 2 ml agara pomeša sa smešom boje i prelije na gel. Pruge se pojavljuju u roku od 15-20 minuta. Reagens L-aminokiselinske oksidaze dodaje se neposredno prije miješanja otopine s rastopljenim agarom.
U ruskim populacijama lokus Pep 1 predstavljen je genotipovima 100/100 i 92/100. Homozigot 92/92 je izuzetno rijedak (oko 0,1%). Locus Rehr 2 predstavljen je s tri genotipa 100/100, 100/112 i 112/112, a sve 3 varijante su prilično česte (Elanky i Smirnov, 2003, slika 2).
Istraživanje genoma
Polimorfizam dužine restriktivnog fragmenta sa naknadnom hibridizacijom (RFLP-RG 57)
Ukupna DNK se tretira restrikcijskim enzimom Eco R1, fragmenti DNK odvajaju se elektroforezom u agaroznom gelu. Nuklearna DNK je vrlo velika i ima mnogo ponavljajućih sekvenci, stoga je teško izravno analizirati brojne fragmente dobijene djelovanjem restrikcijskih enzima. Stoga se fragmenti DNK odvojeni u gelu prenose u posebnu membranu i koriste za hibridizaciju sondom RG 57, koja uključuje nukleotide obilježene radioaktivnim ili fluorescentnim oznakama. Ova sonda hibridizira s ponavljajućim genomskim sekvencama (Goodwin i sur., 1992, Forbes i sur., 1998). Nakon vizualizacije rezultata hibridizacije na lakom ili radioaktivnom materijalu, dobija se multilokusni profil hibridizacije (uzimanje otisaka prstiju), predstavljen sa 25-29 fragmenata (Forbes i sur., 1998). Aseksualni (klonski) potomci imat će iste profile. Po rasporedu traka na elektroforetogramu sude se sličnosti i razlike upoređenih organizama.
Haplotipovi mitohondrijske DNK
U većini eukariotskih ćelija mtDNA je predstavljena u obliku dvolančane kružne molekule DNA koja se, za razliku od nuklearnih hromozoma eukariotskih ćelija, polukonzervativno replicira i nije povezana s molekulama proteina.
Sekvenciran je mitohondrijski genom P. infestans, a niz radova bio je posvećen analizi dužina restrikcijskih fragmenata (Carter i sur, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Nakon što su Griffith i Shaw (1998) razvili jednostavnu i brzu metodu za određivanje mtDNA haplotipova, ovaj marker postao je jedan od najpopularnijih u istraživanjima P. Infestansa. Suština metode sastoji se u sekvencijalnoj amplifikaciji dva fragmenta mitohondrijske DNK (iz zajedničkog genoma) s prajmerima F2-R2 i F4-R4 (Tabela 3) i njihova naknadna restrikcija restrikcijskim enzimima MspI (1. fragment) i EcoR1 (2. fragment). Metoda vam omogućava da identificirate 4 haplotipa: Ia, IIa, Ib, IIb. Tip II razlikuje se od tipa I po prisutnosti umetka veličine 1881 bp i različitom položaju restriktivnih mjesta u regijama P2 i P4 (slika 3).
Od 1996. godine, među sojevima prikupljenim na teritoriji Rusije, zabilježeni su samo haplotipovi Ia i IIa (Elansky i sur., 2001, 2015). Oni se mogu identificirati nakon razdvajanja restriktivnih proizvoda s osnovnim premazom F2-R2 u električnom polju (slike 4, 5). Vrste mtDNA koriste se u uporednoj analizi sojeva i populacija. U brojnim radovima tipovi mitohondrijske DNK korišteni su za izolaciju klonskih linija i pasportizaciju izolata P. infestans (Botez i sur., 2007; Shein i sur., 2009). Korištenjem PCR-RFLP metode zaključeno je da je mtDNA heterogena u istom soju P. infestans (Elansky i Milyutina, 2007). Uvjeti pojačanja: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakcijska smjesa: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polimeraze, 1x 2,5 mM pufera MgCl2-Taq, 0,2 mM svaki dNTP, 30 pM prajmera i 5 ng analizirane DNA, deionizirana voda - do 20 μl.
Ograničenje PCR proizvoda provodi se 4-6 sati na temperaturi od 37 ° C. Restrikciona smjesa (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikcijski pufer (2 μl), dejonizirana voda (6 μl), PCR proizvod (10 μl).
Tabela 3. Primeri koji se koriste za amplifikaciju polimorfnih regija mtDNA
Locus | Primer | Dužina i postavljanje temeljnog premaza | Dužina PCR proizvoda | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Slučajno pojačavanje prajmera (RAPD)
Prilikom provođenja RAPD koristi se jedan prajmer (ponekad nekoliko početnih slojeva istovremeno) s proizvoljnom nukleotidnom sekvencom, obično dužine 10 nukleotida, s visokim sadržajem (od 50%) GC nukleotida i niskom temperaturom žarenja (oko 35 ° C). Takvi početnici "slijeću" na brojna komplementarna mjesta u genomu. Nakon pojačanja dobija se veliki broj amplikona. Njihov broj ovisi o upotrijebljenom (im) početnom sloju (e) i uvjetima reakcije (koncentracija MgCl2 i temperatura žarenja).
Vizualizacija amplikona vrši se destilacijom u poliakrilamidu ili agaroznom gelu. Prilikom izvođenja RAPD analize potrebno je pažljivo pratiti čistoću analiziranog materijala, budući da kontaminacija drugim živim objektima može prouzrokovati značajan porast broja artefakata, koji su prilično brojni u analizi čistog materijala (Perez et al, 1998). Upotreba ove metode u proučavanju genoma P. infestans ogleda se u mnogim radovima (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire i sur., 2002, Carlisle i sur., 2001). Izbor reakcijskih uslova i prajmera (proučavan je 51 prajmer od 10 nukleotida) u članku su dali Abu-El Samen i dr. (2003).
Analiza mikrosatelitskog ponavljanja (SSR)
Mikrosatelitska ponavljanja (jednostavna ponavljanja sekvenci, SSR) tandemno ponavljaju kratke sekvence 1-3 (ponekad i do 6) nukleotida prisutnih u nuklearnim genomima svih eukariota. Broj uzastopnih ponavljanja može varirati od 10 do 100. Mikrosatelitski lokusi javljaju se s prilično visokom frekvencijom i manje-više su ravnomjerno raspoređeni u genomu (Lagercrantz i sur., 1993). Polimorfizam mikrosatelitskih sekvenci povezan je s razlikama u broju ponavljanja osnovnog motiva. Mikrosatelitski markeri su kodominantni, što omogućava da se koriste za analizu strukture stanovništva, određivanje srodstva, puteva migracije genotipa itd. Među ostalim prednostima ovih markera treba istaknuti njihov visoki polimorfizam, dobru reproduktivnost, neutralnost i sposobnost automatske analize i procjene. Analiza polimorfizma mikrosatelitskih ponavljanja provodi se PCR amplifikacijom pomoću primera komplementarnih jedinstvenim sekvencama koji prate bočne mikrosatelitske lokuse. U početku je analiza provedena odvajanjem reakcijskih produkata na poliakrilamidnom gelu. Kasnije su zaposleni u kompaniji Applied Biosystems predložili upotrebu fluorescentno označenih prajmera sa detekcijom proizvoda reakcije pomoću automatskog laserskog detektora (Diehl et al., 1990), a zatim i standardnih automatskih DNA sekvencera (Ziegle et al., 1992). Označavanje prajmera različitim fluorescentnim bojama omogućava vam analizu nekoliko markera odjednom na jednoj traci i, shodno tome, značajno povećavaju produktivnost metode i povećavaju tačnost analize.
Prve publikacije posvećene upotrebi SSR analize za proučavanje P. infestans pojavile su se početkom 2000-ih. (Knapova, Gisi, 2002). Nisu svi markeri koje su predložili autori pokazali dovoljan stupanj polimorfizma, međutim, dva od njih (4B i G11) bila su uključena u skup od 12 SSR markera koje su predložili Lees i suradnici (2006) i potom usvojeni u istraživačkoj mreži Eucablight (www.eucablight .org) kao standard za P. infestans. Nekoliko godina kasnije objavljena je studija o stvaranju sistema za multipleksnu analizu DNK P. infestans na osnovu osam SSR markera (Li i sur., 2010). Konačno, nakon evaluacije svih prethodno predloženih markera i odabira najinformativnijeg od njih, kao i optimizacije primera, fluorescentnih naljepnica i uslova pojačanja, ista grupa autora predstavila je sistem jednostepene multipleks analize, uključujući 12 markera (Tabela 4; Li i sur. , 2013a). Prajmeri korišteni u ovom sistemu odabrani su i označeni jednim od četiri fluorescentna markera (FAM, VIC, NED, PET), tako da se rasponi veličina alela početnih slojeva s istim oznakama ne preklapaju.
Autori su analizu izveli na PTC200 pojačivaču (MJ Research, SAD) koristeći QIAGEN multiplex PCR komplete ili QIAGEN Typeit Microsatellite PCR setove. Zapremina reakcijske smjese bila je 12.5 μL. Uvjeti pojačanja bili su sljedeći: za QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); za QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek.), 58 ° C (90 sek.), 72 ° C (20 sek.), 60 ° C (30 min.).
Razdvajanje i vizualizacija PCR proizvoda izvedeni su pomoću automatskog kapilarnog DNK analizatora ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabela 4. Karakteristike 12 standardnih SSR markera koji se koriste za genotipizaciju P. Infestans (Li i sur., 2013a)
Naslov | Broj alela | Raspon veličina aleli (bp) | Prajmeri |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGAG |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Primjer vizualizacije rezultata analize prikazan je na sl. 6. Rezultati su analizirani pomoću softvera GeneMapper 3.7 upoređivanjem dobijenih podataka sa podacima poznatih izolata. Da bi se olakšala interpretacija rezultata analize, u svaku je studiju potrebno uključiti 1-2 referentna izolata s poznatim genotipom.
Predložena metoda istraživanja testirana je na značajnom broju terenskih uzoraka, nakon čega su autori izvršili standardizaciju protokola između laboratorija dviju organizacija, James Hutton Institute (UK) i Wageningen University & Research (Holandija), što je, uz mogućnost korištenja standardnih FTA kartica za pojednostavljene prikupljanje i otpremanje uzoraka DNK P. infestans, omogućilo je da se govori o mogućnosti komercijalne upotrebe ovog razvoja. Pored toga, brza i precizna metoda genotipizacije izolata P. infestans pomoću multiplex SSR analize omogućila je provođenje standardiziranih studija populacija ovog patogena na globalnom nivou i stvaranje svjetske baze podataka o kasnoj bolesti u okviru projekta Eucablight (www.eucablight.org), uključujući , uključujući rezultate mikrosatelitske analize, omogućilo je praćenje pojave i širenja novih genotipova širom svijeta.
Pojačani polimorfizam dužine restrikcijskog fragmenta (AFLP). AFLP (polimorfizam pojačane dužine fragmenta) je tehnologija za generiranje slučajnih molekularnih markera pomoću specifičnih primera. U AFLP, DNK se tretira kombinacijom dva restrikciona enzima. Određeni adapteri povezani su na ljepljive krajeve restrikcijskih fragmenata.
Ovi se fragmenti zatim pojačavaju pomoću prajmera komplementarnih sekvenci adaptera i restrikcijskim mjestom i dodatno noseći jednu ili više slučajnih baza na njihovim 3 'krajevima. Skup dobivenih fragmenata ovisi o restrikcijskim enzimima i nasumično odabranim nukleotidima na 3'-krajevima početnica (Vos i sur., 1995). AFLP - genotipizacija se koristi za brzo proučavanje genetskih varijacija različitih organizama.
Detaljan opis metode dat je u radovima Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul i dr., 1999. Kineski istraživači izveli su mnogo rada na poređenju rezolucije AFLP i SSR metoda. Proučavane su fenotipske i genotipske karakteristike 48 izolata P. infestans prikupljenih iz pet regija sjeverne Kine. AFLP spektri su otkrili osam različitih DNA genotipova, za razliku od SSR genotipova, za koje nije pronađena raznolikost (Guo i sur., 2008).
Pojačanje prajmerima homološkim sekvencama mobilnih elemenata
Markeri izvedeni iz sekvenci retrotranspozona vrlo su pogodni za genetsko mapiranje, proučavanje genetske raznolikosti i evolucione procese (Schulman, 2006). Ako su prajmeri napravljeni da dopunjuju stabilne sekvence određenih mobilnih elemenata, moguće je pojačati regione genoma koji se nalaze između njih. U studijama uzročnika kasne bolesti, uspješno je primijenjena metoda pojačavanja dijelova genoma primjerom prajmera komplementarnog jezgrenom slijedu retropazona SINE (kratki presječeni nuklearni elementi) (Lavrova i Elansky, 2003). Korištenjem ove metode otkrivene su razlike čak i kod nespolnih potomaka jednog izolata. S tim u vezi, zaključeno je da je inter-SINE - PCR metoda vrlo specifična i da je brzina kretanja SINE elemenata u genomu Phytophthora velika.
U genomu P. infestans identifikovano je 12 porodica kratkih retrotranspozona (SINE); istražena je distribucija vrsta kratkih retrotranspozona, identificirani su elementi (SINE) koji se nalaze u genomu samo P. infestans (Lavrova, 2004).
Karakteristike primene metoda uporednog proučavanja sojeva u populacionim studijama
Kada planirate studiju, potrebno je jasno razumjeti ciljeve kojima ona teži i koristiti odgovarajuće metode. Dakle, neke metode omogućavaju stvaranje velikog broja neovisnih markerskih znakova, ali istodobno imaju nisku ponovljivost i snažno ovise o korištenim reagensima, reakcijskim uvjetima i kontaminaciji ispitivanog materijala. Stoga je u svakoj studiji grupe sojeva potrebno koristiti nekoliko standardnih (referentnih) izolata, ali čak je i u ovom slučaju rezultate nekoliko eksperimenata vrlo teško kombinirati.
Ova grupa metoda uključuje RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Nakon amplifikacije dobije se veliki broj fragmenata DNK različitih veličina. Preporučljivo je koristiti takve tehnike kada je potrebno utvrditi razlike između usko povezanih sojeva (roditeljstvo, mutanti divljeg tipa, itd.) Ili u slučajevima kada je potrebna detaljna analiza malog uzorka. Stoga se AFLP metoda široko koristi u genetskom mapiranju P. infestans (van der Lee i sur., 1997) i u intrapopulacijskim istraživanjima (Knapova, Gisi, 2002, Cooke i sur, 2003, Flier i sur, 2003). Takve metode je nepraktično koristiti prilikom stvaranja baza podataka sojeva, budući da praktično je nemoguće objediniti računovodstvo rezultata prilikom provođenja analiza u različitim laboratorijama.
Uprkos naizglednoj jednostavnosti i brzini izvođenja (izolacija DNK bez dobrog pročišćavanja, pojačavanja, vizualizacije rezultata), ova grupa metoda zahtijeva upotrebu posebne metode za dokumentiranje rezultata: destilacija u poliakrilamidnom gelu s označenim (radioaktivnim ili luminiscentnim) prajmerima i naknadno izlaganje svjetlosti ili radioaktivnom materijalu. Konvencionalno snimanje etidij-bromid-agaroznog gela uglavnom nije pogodno za ove metode jer veliki broj fragmenata DNK različitih veličina može se stopiti.
Druge metode, naprotiv, omogućuju generiranje malog broja svojstava s njihovom vrlo visokom ponovljivošću. Ova skupina uključuje proučavanje haplotipova mitohondrijske DNK (u Rusiji su zabilježena samo dva haplotipa Ia i IIa), tipa parenja (većina izolata podijeljena je na 2 tipa: A1 i A2, samooplodni SF se rijetko nalazi) i izoptidni spektri peptidaze (dva lokusa Pep1 i Pep2 , koji se sastoji od po dva izozima) i glukoza-6-fosfat izomeraze (u Rusiji nema varijabilnosti u ovoj osobini, iako je značajan polimorfizam zabilježen u drugim zemljama svijeta). Preporučljivo je koristiti ove značajke prilikom analize zbirki, sastavljanja regionalnih i globalnih baza podataka. U slučaju analize izozima i haplotipova mitohondrijske DNK moguće je uopće bez standardnih sojeva, dok su u analizi tipova parenja potrebna dva test izolata s poznatim tipovima parenja.
Uvjeti reakcije i reagensi mogu utjecati samo na kontrast proizvoda na elektroforetogramu; pojava artefakata u ovim vrstama studija je malo vjerojatna.
Trenutno većinu populacija u evropskom dijelu Rusije predstavljaju sojevi obje vrste parenja (Tabela 6.), među njima postoje izolati s tipovima Ia i IIa mitohondrijske DNK (druge vrste mtDNA pronađene u svijetu nisu nađene u Rusiji nakon 1993. godine). Spektri izoenzima peptidaze predstavljaju dva genotipa na lokusu Pep1 (100/100, 92/92 i heterozigoti 92/100, a genotip 92/92 je izuzetno rijedak (<0,3%)) i dva genotipa na lokusu Pep 2 (100/100 , 112/112 i heterozigota 100/112, s genotipom 112/112 koji se javlja rjeđe od 100/100, ali i prilično često).
Nije bilo varijabilnosti u spektru izoenzima glukoza-6-fosfat izomeraze nakon 1993. godine (nestanak klonske linije US-1); svi ispitivani izolati imali su genotip 100/100 (Elansky i Smirnov, 2002).
Treća grupa metoda omogućava dobivanje dovoljne skupine nezavisnih znakova markera s visokom obnovljivošću. Danas ova grupa uključuje sondu RFLP-RG57 koja proizvodi 25-29 fragmenata DNK različitih veličina. RFLP-RG57 se može koristiti i za analizu uzoraka i za sastavljanje baza podataka. Međutim, ova metoda je mnogo skuplja od prethodnih, dugotrajna je i zahtijeva dovoljno veliku količinu visoko pročišćene DNK. Stoga je istraživač prisiljen ograničiti količinu ispitivanog materijala.
Razvoj RFLP-RG57 početkom 90-ih godina prošlog veka značajno je intenzivirao populacione studije uzročnika kasne bolesti. Postala je osnova metode zasnovane na odabiru i analizi "Klonskih linija" (vidi dole). Zajedno s RFLP-RG57, za identifikaciju klonskih linija koriste se tip parenja, DNK otisci prstiju (RFLP-RG57 metoda), spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze i mitohondrijski DNK. Zahvaljujući njemu, prikazano je dr., 1994.), identificirane su zamjene starih populacija novima (Drenth i sur., 1993., Sujkowski i sur., 1994., Goodwin i sur., 1995.) i utvrđene su klonske loze koje prevladavaju u mnogim zemljama svijeta. Studije ruskih sojeva korištenjem ove metode pokazale su visok genotipski polimorfizam sojeva evropskog dijela i monomorfizam populacija azijskog i dalekog istoka Rusije (Elansky et al, 2001). I sada ova metoda ostaje glavna u populacijskim istraživanjima P. infestans. Međutim, njegovu široku distribuciju ometaju prilično visoki troškovi i intenzitet rada u izvršenju.
Još jedna obećavajuća tehnika koja se rijetko koristi u studijama P. infestans je analiza mikrosatelitskog ponavljanja (SSR). Trenutno se ova metoda široko koristi za izolaciju klonskih linija. Za analizu sojeva široko su se koristile (i dalje se koriste) takve fenotipske bilježne osobine kao prisustvo gena virulencije za sorte krompira (Avdey, 1995, Ivanyuk i sur., 2002, Ulanova i sur., 2003) i paradajz. Do sada su geni virulencije prema sortama krompira izgubili vrijednost kao marker obilježja za populacijske studije zbog pojave maksimalnog (ili blizu njega) broja gena virulencije u velikoj većini izolata. Istovremeno, gen virulencije T1 za sorte paradajza koji nose odgovarajući gen Ph1 i dalje se uspješno koristi kao obilježje markera (Lavrova i sar., 2003; Ulanova i sar., 2003).
U mnogim radovima se otpornost na fungicide koristi kao obilježje markera. Ova je osobina nepoželjna za upotrebu u populacijskim studijama zbog prilično lagane pojave mutacija rezistencije na klonskim linijama nakon primjene fungicida koji sadrže metalaksil- (ili mefenoksam-) na terenu. Na primjer, značajne razlike u nivou rezistencije prikazane su unutar klonske linije Sib1 (Elansky i sur., 2001).
Stoga su tip parenja, spektri izoptima peptidaze, tip mitohondrijske DNK, RFLP-RG57, SSR preferirani markeri za stvaranje banaka podataka i obilježavanje sojeva u kolekcijama. Ako želite uporediti ograničene uzorke, ako je potrebno koristiti maksimalan broj karakteristika markera, možete koristiti AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tabela 5). Međutim, treba imati na umu da se ove metode slabo mogu ponoviti, te je u svakom pojedinačnom eksperimentu (ciklus elektroforeze pojačavanja) potrebno koristiti nekoliko referentnih izolata.
Tabela 5. Usporedba različitih metoda istraživanja sojeva P. infestans
Kriterij | TS | Isofer policajci | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Količina informacija | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Ponovljivost | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Mogućnost artefakata | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
trošak | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intenzitet rada | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Brzina analize ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Napomena: H - nisko, C - srednje, B - visoko; NS * - intenzitet rada je nizak kada se koristi agarozni gel ili automatski
genotip, srednji - destilacijom u poliakrilamidnom gelu sa označenim prajmerima,
** - ne računajući vrijeme provedeno na uzgoju micelija za izolaciju DNK.
Struktura stanovništva
Klonske linije
U nedostatku rekombinacije ili njenog beznačajnog doprinosa strukturi populacije, populacija se sastoji od određenog broja klonova, između kojih su genetske razmjene izuzetno rijetke.
U takvim populacijama informativnije je proučavati ne frekvencije pojedinačnih gena, već frekvencije genotipova koji imaju zajedničko porijeklo (klonske linije ili klonske loze) i razlikuju se samo u točkovnim mutacijama. Studije stanovništva patogena kasne plamenje i analiza klonskih linija značajno su se ubrzale od pojave RFLP-RG57 metode ranih 90-ih godina prošlog vijeka. Zajedno s RFLP-RG57, tipovi parenja, spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze i mitohondrijski DNK koriste se za identifikaciju klonskih linija. Karakteristike najčešćih klonskih linija prikazane su u Tabeli 6.
Klonirajte populaciju SAD-1 posvuda do kraja 80-ih, nakon čega su je počeli zamjenjivati drugi klonovi i nestajati iz Evrope i Sjeverne Amerike. Sada se nalazi na Dalekom istoku (Filipini, Tajvan, Kina, Japan, Koreja, Koh i dr., 1994, Mosa i dr., 1993), u Africi (Uganda, Kenija, Ruanda, Goodwin i ostali, 1994, Vega-Sanchez i dr.) al., 2000; Ochwo i sur., 2002) i u Južnoj Americi (Ekvador, Brazil, Peru, Forbes i sur., 1997, Goodwin i sur., 1994). Samo u Australiji nisu identifikovani sojevi koji pripadaju liniji US-1. Očigledno su izolati P. infestans došli u Australiju s drugim valom migracije (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migrirao je iz sjevernog Meksika u Kaliforniju krajem 70-ih i izazvao epidemiju krompira i paradajza nakon 32 godine bez bolesti. Zbog svoje visoke agresivnosti istisnuo je klon US-1 i počeo dominirati zapadnom obalom Sjedinjenih Država (Goodwin i sur., 1995a).
Genotipovi US-7 i US-8 otkriveni su u Sjedinjenim Državama 1992. godine, a već 1994. godine su široko rasprostranjeni u Sjedinjenim Državama i Kanadi. Tokom jedne poljske sezone klon US-8 je u stanju gotovo u potpunosti istisnuti klon US-1 na parcelama krompira u početku zaraženim s oba klona u jednakoj koncentraciji (Miller i Johnson, 2000).
Klonovi BC-1 do BC-4 identificirani su u Britanskoj Kolumbiji u malom broju izolata iz Goodwin i dr., 1995b). Klon US-11 široko se proširio u Sjedinjenim Državama i potisnuo US-1 na Tajvanu. Klonovi JP-1 i EC-1, zajedno sa klonom US-1, česti su u Japanu, odnosno Ekvadoru (Koh i sur., 1994; Forbes i sur., 1997).
SIB-1 je klon koji je u Rusiji prevladavao na ogromnoj teritoriji od Moskovske regije do Sahalina. U Moskovskoj regiji otkriven je 1993. godine, a neke poljske populacije sastojale su se uglavnom od sojeva ove klonske linije, vrlo otpornih na metalaksil. Nakon 1993. godine, prevalencija ovog klona značajno se smanjila. Izvan Urala 1997-1998., SIB-1 je pronađen svuda, osim na teritoriji Habarovsk (tamo je raširen klon SIB-2). Prostorno razdvajanje klonova s različitim vrstama parenja isključuje seksualni proces u Sibiru i na Dalekom Istoku. U Moskovskoj regiji, za razliku od Sibira, stanovništvo je predstavljeno mnogim klonovima; gotovo svaki izolat ima jedinstveni multilokusni genotip (Elansky i sur., 2001., 2015). Ova raznolikost ne može se objasniti samo uvozom sojeva gljivica iz različitih dijelova svijeta uvoznim sjemenskim materijalom. Budući da se obje vrste parenja javljaju u populaciji, moguće je da je njegova raznolikost posljedica i rekombinacije. Dakle, u Britanskoj Kolumbiji pretpostavlja se pojava genotipova BC-2, BC-3 i BC-4 zbog hibridizacije klonova BC-1 i US-6 (Goodwin i sur., 1995b). Moguće je da se hibridni sojevi nalaze u moskovskim populacijama. Na primjer, sojevi MO-4, MO-8 i MO-11 heterozigotni za PEP lokus mogu biti hibridi između sojeva MO-12, MO-21, MO-22, koji imaju A2 tip uparivanja i homozigoti za jedan alel PEP lokusa i soja MO-8, koji ima A1 tip parenja i homozigotan za drugi alel lokusa. A ako je to tako, a u modernim populacijama P. infestans postoji tendencija povećanja uloge spolnog procesa, tada će se informacijska vrijednost analize multilokusnih klonova smanjiti (Elansky i sur., 2001, 2015).
Varijacije u klonskim linijama
Do 90-ih godina 20. vijeka, klonska linija US-1 bila je raširena u svijetu. Većina poljske i regionalne populacije sastojala se isključivo od sojeva s genotipom US-1. Međutim, uočene su i razlike između izolata, najvjerojatnije uzrokovane mutacijskim procesom. Mutacije su se dogodile i u nuklearnoj i u mitohondrijskoj DNK i utjecale su, između ostalog, na nivo otpornosti na lijekove s fenilamidom i na broj gena virulencije. Linije koje se razlikuju od izvornih genotipova mutacijama označene su dodatnim brojevima nakon tačke koja slijedi ime izvornog genotipa (na primjer, mutantna linija US-1.1 klonske linije US-1). DNK linije otiska prsta US-1.5 i US-1.6 sadrže pomoćne linije različitih veličina (Goodwin i sur., 1995a, 1995b); klonska linija US-6.3 takođe se razlikuje od US-6 po jednoj dodatnoj liniji (Goodwin, 1997, tabela 7).
U istraživanju mitohondrijske DNK utvrđeno je da je u klonskoj liniji US-1 pronađen samo mitohondrijski DNK tipa 1b (Carter i sur., 1990). Međutim, u proučavanju sojeva ove klonske loze iz Perua i Filipina pronađeni su izolati čiji su se mitohondrijski tipovi DNK razlikovali od 1b prisustvom insercija i delecija (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabela 6. Multilokusni genotipovi nekih klonskih linija P. infestans
Naslov | Tip parenja | Isozymes | DNK otisci prstiju | MtDNA tip | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011E + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011E + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011E + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011E + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011E + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011E + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011E + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011E + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
EC-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011E + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011E + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011E + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011E + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011E + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011E + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011E + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011E + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011E + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011E + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011E + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011E + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011E + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011E + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011E + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011E + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011E + 24 | IIa |
Napomena: * - nema podataka.
Tabela 7. Multilokusni genotipovi i njihove mutirane linije
Naslov | Tip parenja | | DNK otisci prstiju (RG57) | Napomene | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Izvorni genotip 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutacija u PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija u RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutacija u RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija u RG57 i PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutacija u RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Izvorni genotip 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutacija u PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutacija u RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutacija u RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutacija u RG57 i PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutacija u RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Izvorni genotip 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutacija u RG57 |
Takođe postoje promjene u spektrima izoenzima. Oni su u pravilu uzrokovani razgradnjom organizma u početku heterozigotnog za ovaj enzim u homozigotni. Godine 1993. na plodovima paradajza identificirali smo soj sa karakteristikama karakterističnim za US-1: RG57 otisak prsta, mitohondrijski DNK tip i 86/100 genotip za glukoza-6-fosfati-izomerazu, ali je bio homozigot (100/100) za prvi peptidazni lokus umjesto heterozigot 92/100 tipičan za ovu klonsku liniju. Nazvali smo genotip ovog soja MO-17 (Tabela 6). Mutantne linije US-1.1 i US-1.4 takođe se razlikuju od US-1 mutacijama na prvom lokusu peptidaze (Tabela 7).
Mutacije koje dovode do promjena u broju virulentnih gena za sorte krompira i paradajza su prilično česte. Uočeni su među izolatima klonske linije US-1 u populacijama iz Holandije (Drenth i sur., 1994), Perua (Goodwin i sur., 1995a), Poljske (Sujkowski i sur., 1991), sjeverne Sjeverne Amerike (Goodwin i sur., ., 1995b). Razlike u broju gena virulencije krompira zabilježene su i među izolatima klonskih linija US-7 i US-8 u Kanadi i Sjedinjenim Državama (Goodwin i sur., 1995a), među izolatima linije SIB-1 u azijskom dijelu Rusije (Elansky i sur, 2001. ).
Izolati s jakim razlikama u nivoima rezistencije na lijekove s fenilamidom identificirani su u monoklonskim populacijama polja, koje su sve pripadale klonskoj liniji Sib-1 (Elansky i sur, 2001., Tabela 1). Gotovo svi sojevi klonske linije US-1 vrlo su osjetljivi na metalaksil, međutim, visoko otporni izolati te linije izolirani su na Filipinima (Koh et al., 1994) i u Irskoj (Goodwin et al., 1996).
Savremene populacije P. infestans
Centralna Amerika (Meksiko)
Populacija P. infestans u Meksiku se značajno razlikuje od ostalih svjetskih populacija, što je prije svega zbog njenog povijesnog položaja. Brojne studije ove populacije i srodnih vrsta P. infestans klade Phytophthora, kao i lokalnih vrsta roda Solanum, dovele su do zaključka da se evolucija patogena u središnjem dijelu Meksika odvijala zajedno s evolucijom biljaka domaćina i bila povezana sa seksualnom rekombinacijom (Grünwald, Flier , 2005.). Obje vrste parenja zastupljene su u populaciji, i to u jednakim omjerima, a prisustvo oospora u tlu, na biljkama i gomoljima krumpira i samoniklim srodnim vrstama Solanum potvrđuje prisustvo spolnog procesa u populaciji (Fernández-Pavía et al., 2002). Nedavna istraživanja doline Toluke i okoline (pretpostavljeni centar nastanka patogena) potvrdili su visoku genetsku raznolikost lokalne populacije P. infestans (134 multilokusna genotipa u uzorku od 176 uzoraka) i prisustvo nekoliko diferenciranih subpopulacija u regiji (Wang et al., 2017). Čimbenici koji doprinose ovoj diferencijaciji su prostorna podjela subpopulacija karakteristična za gorje središnjeg Meksika, razlike u uvjetima uzgoja i sortama krompira koji se koriste u dolinama i planinama, te prisustvo divljih gomoljastih vrsta Solanum koje mogu djelovati kao alternativni domaćini (Fry i sur. ., 2009).
Međutim, treba napomenuti da su populacije P. infestans u sjevernom Meksiku po svojoj prirodi više klonske i sličnije su sjevernoameričkim populacijama, što može ukazivati na to da su to novi genotipovi (Fry et al., 2009).
Sjeverna Amerika
Sjevernoameričke populacije P. infestans uvijek su imale vrlo jednostavnu strukturu i njihov klonski karakter uspostavljen je mnogo prije upotrebe mikrosatelitske analize. Do 1987. godine klonska linija US-1 dominirala je u Sjedinjenim Državama i Kanadi (Goodwin i sur., 1995). Sredinom sedamdesetih godina, kada su se pojavili fungicidi na bazi metalaksila, ovaj klon počeo je zamjenjivati drugi, otporniji genotipovi koji su migrirali iz Meksika (Goodwin et al., 70). Krajem 1998-ih. genotip US-90 u potpunosti je zamijenio genotip US-8 u Sjedinjenim Državama i postao dominantna klonska linija na krumpiru (Fry i sur., 1; Fry i sur., 2009). Situacija je bila drugačija s rajčicama, koje su stalno sadržavale nekoliko klonskih linija, a njihov se sastav mijenjao iz godine u godinu (Fry i sur., 2015).
2009. godine u Sjedinjenim Državama izbila je velika epidemija kasne bolesti na paradajzu. Značajka ove pandemije bila je gotovo istodobna pojava na mnogim mjestima na sjeveroistoku Sjedinjenih Država, a ispostavilo se da je povezana s masovnom prodajom zaraženih sadnica paradajza u velikim vrtnim centrima (Fry i sur., 2013). Gubici usjeva bili su ogromni. Mikrosatelitska analiza zahvaćenih uzoraka otkrila je da je soj pandemije pripadao tipu parenja klonske linije US-22 A2. U 2009. godini udio ovog genotipa u američkoj populaciji P. infestans dosegao je 80% (Fry i sur., 2013). U narednim godinama, udio agresivnih genotipova US-23 (uglavnom na paradajzu) i US-24 (na krompiru) neprestano se povećavao u populaciji, međutim, nakon 2011. godine, stopa otkrivanja US-24 značajno se smanjila i do danas je oko 90% populacije patogena u Sjedinjene Države predstavljaju genotip US-23 (Fry et al., 2015).
U Kanadi, kao i u Sjedinjenim Državama, krajem 90-ih. dominantni genotip US-1 zamijenio je US-8, čiji je dominantni položaj ostao nepromijenjen do 2008. U 2009-2010. U Kanadi su postojale ozbiljne epidemije kasne bolesti koje su povezane s prodajom zaraženih sadnica paradajza, ali su ih uzrokovali genotipovi US-23 i US-8 (Kalischuk et al., 2012). Jasna geografska diferencijacija ovih genotipova bila je izvanredna: SAD-23 dominirali su zapadnim provincijama Kanade (68%), dok su SAD-8 dominirali istočnim provincijama (83%). U narednim godinama SAD-23 se proširio na istočne regije, međutim, općenito se njegov udio u populaciji blago smanjio u odnosu na pojavu genotipova US-22 i US-24 u zemlji (Peters i sur., 2014). Do danas, US-23 zadržava dominantan položaj širom Kanade; US-8 prisutan je u Britanskoj Kolumbiji, dok su US-23 i US-24 prisutni u Ontariju (Peters, 2017).
Dakle, sjevernoameričke populacije P. infestans uglavnom su klonske linije. U proteklih 40 godina, broj otkrivenih klonskih genotipova dosegao je 24. Uprkos činjenici da su u populaciji prisutni sojevi oba tipa parenja, vjerovatnoća pojave novih genotipova kao rezultat seksualne rekombinacije i dalje je prilično niska. Ipak, u proteklih 20 godina zabilježeno je nekoliko slučajeva pojave efemernih rekombinantnih populacija (Gavino i sur., 2000.; Danies i sur., 2014.; Peters i sur., 2014.), a u jednom slučaju rezultat ukrštanja bio je genotip US-11 , koja je bila ukorijenjena u Sjevernoj Americi dugi niz godina (Gavino i sur., 2000.). Do 2009. godine promjene u strukturi populacija bile su povezane s pojavom novih, agresivnijih genotipova s njihovim naknadnim migracijama i raseljavanjem prethodno dominantnih prethodnika. Šta se dogodilo u 2009-2010 u SAD-u i Kanadi epifitotici su prvi put pokazali da u eri globalizacije izbijanje bolesti može biti povezano s aktivnim širenjem novih genotipova prilikom prodaje zaraženog sadnog materijala.
Južna Amerika
Do nedavno, proučavanja južnoameričkih populacija P. infestans nisu bila redovna ni velika. Poznato je da je struktura ovih populacija prilično jednostavna i uključuje 1-5 klonskih loza po zemlji (Forbes i sur., 1998). Dakle, do 1998. genotipovi US-1 (Brazil, Čile) BR-1 (Brazil, Bolivija, Urugvaj, Paragvaj), EC-1 (Ekvador, Kolumbija, Peru i Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 i AR-5 (Argentina), PE-3 i PE-7 (južni Peru). Parenje tipa A2 bilo je prisutno u Brazilu, Boliviji i Argentini i nije pronađeno izvan bolivijsko-peruanske granice na području jezera Titicaca, iza kojeg je genotip EC-1 A1 dominirao u Andama. Na paradajzu, US-1 je ostao dominantan genotip u cijeloj Južnoj Americi.
Situacija se manje-više zadržala 2000-ih. Važno je bilo otkriće nove klonske linije EC-2 tipa A2 na divljim srodnicima krompira (S. brevifolium i S. tetrapetalum) u sjevernim Andama (Oliva i sur., 2010). Filogenetske studije pokazale su da ova linija nije u potpunosti identična P. infestans, iako je s njom usko povezana, s tim u vezi predloženo je da se razmatra, kao i druga linija, EC-3, izolirana iz stabla rajčice S. betaceum koja raste u Andama, nova vrsta zvana P. andina; međutim, status ove vrste (neovisna vrsta ili hibrid P. infestans s nekom još uvijek nepoznatom linijom) još uvijek nije jasan (Delgado et al., 2013).
Trenutno su sve južnoameričke populacije P. infestans klonske. Uprkos prisutnosti obje vrste parenja, nisu identificirane rekombinantne populacije. Na paradajzu je genotip US-1 sveprisutan, očigledno je potisnut iz krompira lokalnim sojevima, čije tačno porijeklo još uvijek nije poznato. U Brazilu, Boliviji i Urugvaju prisutan je genotip BR-1; u Peruu, uz US-1 i EC-1, postoji još nekoliko lokalnih genotipova. U Andama dominantan položaj zadržava klonska linija EC-1, čiji odnos sa nedavno otkrivenom P. andinom ostaje neistražen. Jedino "nestabilno" mjesto gdje je za period 2003-2013. došlo je do značajnih promjena u populaciji, postao je Čile (Acuña et al., 2012), gdje je 2004.-2005. populaciju patogena karakterizira otpornost na metalaksil i novi haplotip mitohondrijske DNA (Ia umjesto ranije prisutnog Ib). 2006. do 2011. godine u populaciji je dominirao genotip 21 (prema SSR-u) čiji je udio dosegao 90%, nakon čega je dlan prešao na genotip 20, čija je učestalost pojave u naredne dvije godine zadržana na oko 67% (Acuña, 2015).
Evropa
U istoriji Evrope dogodila su se najmanje dva vala migracije P. infestans iz Sjeverne Amerike: u 1. stoljeću. (HERB-1) i početkom 70. vijeka (US-1). Sveprisutna distribucija fungicida koji sadrže metalaksil u XNUMX-ima. dovelo je do raseljavanja dominantnog genotipa US-XNUMX i njegove zamjene novim genotipovima. Kao rezultat toga, u većini zemalja zapadne Evrope populacije patogena bile su zastupljene uglavnom sa nekoliko klonskih linija.
Upotreba mikrosatelitske analize za analizu populacija patogena omogućila je otkrivanje ozbiljnih promjena koje su se dogodile u zapadnoj Europi u periodu 2005.-2008. 2005. U Velikoj Britaniji je otkrivena nova klonska linija nazvana 13_A2 (ili „Plava 13“), koju karakterizira tip parenja A2 , visoka agresivnost i otpornost na fenilamide (Shaw et al., 2007). Isti genotip pronađen je u uzorcima prikupljenim 2004. godine u Holandiji i sjevernoj Francuskoj, što sugerira da je u Veliku Britaniju migrirao iz kontinentalne Evrope, moguće sa sjemenskim krumpirom (Cooke et al., 2007). Proučavanje genoma predstavnika ove klonske linije pokazalo je visok stepen polimorfizma njegove sekvence (do 2016. broj njegovih subklonalnih varijacija dostigao je 340) i značajan stupanj varijacije u nivou ekspresije gena, uklj. efektorski geni tokom biljne infekcije (Cooke i sar., 2012; Cooke, 2017). Ove osobine, zajedno sa produženim trajanjem biotrofne faze, mogu izazvati povećanu agresivnost 13_A2 i njegovu sposobnost da zarazi čak i sorte krompira otporne na kasnu bolest.
U sljedećih nekoliko godina genotip se brzo širio zemljama sjeverozapadne Evrope (Velika Britanija, Irska, Francuska, Belgija, Holandija, Njemačka) uz istovremeno istiskivanje prethodno dominantnih genotipova 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry i sur., 2010; Gisi i sur. , 2011; Van den Bosch i dr., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Prema veb stranici www.euroblight.net, udeo 13_A2 u stanovništvu ovih zemalja dostigao je 60-80% i više; prisustvo ovog genotipa zabilježeno je i u nekim zemljama istočne i južne Evrope. Međutim, u 2009-2012. 13_A2 izgubio je svoje dominantne položaje u Velikoj Britaniji i Francuskoj, popuštajući liniji 6_A1 (8_A1 u Irskoj), a u Holandiji i Belgiji djelomično je zamijenjen genotipovima 1_A1, 6_A1 i 33_A2 (Cooke i sur., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Do danas je oko 70% zapadnoevropske populacije P. infestans monoklonsko. Prema web stranici www.euroblight.net, dominantni genotipovi u zemljama sjeverozapadne Evrope (UK, Francuska,
Holandija, Belgija) ostaju, približno u jednakim omjerima, 13_A2 i 6_A1, potonji se praktično ne nalaze izvan navedene regije (s izuzetkom Irske), ali već imaju najmanje 58 podklona (Cooke, 2017). Varijacije 13_A2 prisutne su u primjetnom broju u Njemačkoj, a sporadično se primjećuju i u zemljama srednje i južne Evrope. Genotip 1_A1 čini značajan dio populacije Belgije i djelomično Holandije i Francuske. Genotip 8_A1 stabilizirao se u europskoj populaciji na razini od 3-6%, s izuzetkom Irske, gdje zadržava vodeću poziciju i podijeljen je u dva podklona (Stellingwerf, 2017). Konačno, 2016. godine zabilježen je porast učestalosti pojave novih genotipova 36_A2 i 37_A2, prvi put zabilježen u 2013-2014; do danas se ti genotipovi nalaze u Holandiji i Belgiji, dijelom u Francuskoj i Njemačkoj, kao i u južnom dijelu Velike Britanije (Cooke, 2017). Otprilike 20-30% populacije zapadne Evrope svake godine predstavljaju jedinstveni genotipovi.
Za razliku od zapadne Evrope, do pojave genotipa 13_A2, populacije sjeverne Evrope (Švedska, Norveška, Danska, Finska) nisu bile predstavljene klonskim linijama, već velikim brojem jedinstvenih genotipova (Brurberg et al.,
2011). Tokom perioda aktivnog širenja 13_A2 u zapadnoj Evropi, prisustvo ovog genotipa u Skandinaviji nije zabilježeno sve do 2011. godine, kada je prvi put otkriven u Sjevernom Jutlandu (Danska), gdje se uglavnom uzgajaju industrijske sorte krompira uz aktivnu upotrebu metalaksila koji sadrže fungicidi (Nielsen i sar., 2014). Prema www.euroblight.net, genotip 13_A2 je takođe otkriven u nekoliko uzoraka iz Norveške i Danske 2014. godine i u nekoliko norveških uzoraka 2016. godine; pored toga, 2013. godine u Finskoj je zabilježeno prisustvo genotipa 6_A1 u maloj količini. Glavnim razlogom neuspjeha 13_A2 i ostalih klonskih linija u osvajanju Skandinavije smatraju se klimatske razlike ove regije od zemalja zapadne Evrope.
Pored činjenice da prohladna ljeta i hladne zime doprinose preživljavanju oospora, a ne vegetativnog micelija (Sjöholm i sur., 2013.), smrzavanje tla zimi (što se obično ne događa u toplijim zemljama zapadne Evrope) doprinosi sinhronizaciji klijanja i sadnje oospora. krumpir, što povećava njihovu ulogu kao izvora primarne infekcije (Brurberg i sur., 2011). Također treba napomenuti da, u sjevernim uvjetima, razvoj infekcije oosporama nadmašuje razvoj gomoljaste infekcije, što u konačnici sprječava dominaciju još agresivnijih, ali kasnije razvijenih klonskih linija (Yuen, 2012). Struktura najproučenijih populacija P. infestans u istočnoj Evropi (Poljska, baltičke države) vrlo je slična onoj u Skandinaviji.
Ovdje su prisutne i obje vrste parenja, a velika većina genotipova utvrđenih SSR analizom jedinstvena je (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Kao i u sjevernoj Evropi, širenje klonskih linija (prvenstveno genotipa 13_A2) praktično nije utjecalo na lokalne populacije patogena, koje zadržavaju visok nivo raznolikosti uz odsustvo izraženih dominantnih linija.
Prisustvo 13_A2 povremeno se zapaža na poljima sa komercijalnim sortama krompira. U Rusiji se situacija razvija na sličan način. Mikrosatelitska analiza izolata P. infestans prikupljenih 2008-2011 u 10 različitih regija evropskog dijela Rusije, pokazali su visok stepen genotipske raznolikosti i potpuni nedostatak podudarnosti s evropskim klonskim linijama (Statsyuk et al., 2014). Nekoliko godina kasnije, studija uzoraka P. infestans prikupljenih u Lenjingradskoj regiji u 2013-2014. Godini pokazala je značajne razlike između njih i genotipova iz ove regije identifikovanih u prethodnoj studiji. U obje studije nisu pronađeni genotipovi zapadne Evrope (Beketova i sar., 2014; Kuznetsova i sar., 2016).
Velika genetska raznolikost istočnoevropskih populacija P. infestans i odsustvo dominantnih klonskih linija u njima mogu biti iz više razloga. Prvo, kao i u sjevernoj Evropi, klimatski uslovi u razmatranim zemljama doprinose stvaranju oospora kao primarnog izvora zaraze (Ulanova i sar., 2010; Chmielarz i sar., 2014). Drugo, značajan udio krompira proizvedenog u tim zemljama uzgaja se na malim privatnim farmama, često okružen šumama ili drugim preprekama slobodnom kretanju zaraznog materijala (Chmielarz et al., 2014). Krumpir uzgajan u takvim uvjetima u pravilu se praktički ne tretira kemikalijama, a izbor sorti temelji se na otpornosti na kasnu mrlju, tj. ne postoji selektivni pritisak za agresivnost i otpornost na metalaksil, što rezistentnim genotipovima, poput 13_A2, oduzima prednosti u odnosu na druge genotipove (Chmielarz i sur., 2014). Konačno, zbog male veličine zemljišnih parcela, njihovi vlasnici obično ne prakticiraju plodored, uzgajajući krumpir godinama na istom mjestu, što doprinosi akumulaciji genetski raznolikog inokuluma (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Azija
Do nedavno, struktura populacija P. infestans u Aziji i dalje je bila relativno slabo razumljiva. Znalo se da ga predstavljaju uglavnom klonske linije, a učinak seksualne rekombinacije na pojavu novih genotipova je vrlo mali. Tako je, na primjer, 1997-1998. U azijskom dijelu Rusije (Sibir i Daleki Istok) populaciju patogena predstavljala su samo tri genotipa s prevlašću genotipa SIB-1 (Elansky i sur., 2001). Prisustvo linija klonskih patogena pokazano je u zemljama kao što su Kina, Japan, Koreja, Filipini i Tajvan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klonska linija US-1 dominirala je na velikom teritoriju Azije krajem 90-ih - početkom 2000-ih. gotovo svugdje su počeli da ih zamjenjuju drugi genotipovi, koji su pak ustupili mjesto novim. U većini slučajeva promjene u strukturi i sastavu populacija u azijskim zemljama bile su povezane s migracijom novih genotipova izvana. Dakle, u Japanu, osim genotipa JP-3, svi drugi japanski genotipovi koji su se pojavili nakon US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) imaju manje ili više dokazano vanjsko porijeklo (Akino i sur., 2011) ... U Kini trenutno postoje tri glavne populacije patogena s jasnom geografskom podjelom; Između ovih populacija ne postoji ili je vrlo slab protok gena (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotip 13_A2 pojavio se na teritoriji Kine u njenim južnim provincijama (Junan i Sečuan) u periodu 2005.-2007., Te 2012.-1014. viđena je i na sjeveroistoku zemlje (Li i sur., 2013b). U Indiji se 13_A2 pojavio vjerovatno u isto vrijeme kada i u Kini, najvjerovatnije sa zaraženim sjemenskim krumpirom (Chowdappa et al., 2015), te u 2009.-2010. izazvao je ozbiljnu epifitozu kasne bolesti na paradajzu na jugu zemlje, nakon čega se proširio na krumpir i 2014. izazvao pojavu kasne bolesti u zapadnom Bengalu, što je dovelo do propasti i samoubistva mnogih lokalnih farmera (Fry, 2016).
Afrika
Do 2008-2010 sistematska ispitivanja P. infestans u afričkim zemljama nisu provedena. Trenutno se afričke populacije P. infestans mogu podijeliti u dvije skupine, a ta je podjela jasno povezana s činjenicom uvoza sjemenskog krompira iz Evrope.
U sjevernoj Africi, koja aktivno uvozi sjemenski krompir iz Evrope, tip parenja A2 široko je zastupljen u gotovo svim regijama, što pruža teoretsku mogućnost pojave novih genotipova kao rezultat seksualne rekombinacije (Corbière i sur., 2010; Rekad i sur., 2017). Pored toga, u Alžiru se zapaža prisustvo genotipova 13_A2, 2_A1 i 23_A1 uz izraženu dominaciju prvog od njih, kao i postepeno smanjenje udjela jedinstvenih genotipova do potpunog nestanka (Rekad i sur., 2017.). Za razliku od ostatka regije, u Tunisu (sa izuzetkom sjeveroistoka zemlje), populacija patogena je uglavnom predstavljena tipom parenja A1 (Harbaoui i sur., 2014).
Ovdje je dominantna klonska linija NA-01. Generalno, udio klonskih linija u populaciji je samo 43%. U istočnoj i južnoj Africi, gdje je količina uvoza sjemena nestajuće mala (Fry i sur., 2009), P. infestans predstavljaju samo dvije klonske linije tipa A1, US-1 i KE-1, a druga aktivno istiskuje prvu na krumpiru ( Pule i sur., 2012; Njoroge i sur., 2016). Do danas, oba ova genotipa imaju primjetan broj subklonalnih varijacija.
Австралия
Prvo izvještavanje o kasnoj bolesti na krompiru u Australiji datira još iz 1907. godine, a prva epifitotija, koja je vjerovatno prouzrokovana jakim kišama u ljetnim mjesecima, dogodila se u periodu 1909-1911. (Drenth i dr., 2002). Općenito, međutim, kasna bolest nije značajna ekonomska važnost za zemlju. Sporadični napadi kasne bolesti, izazvani vremenskim uvjetima koji pružaju visoku vlažnost zraka, javljaju se ne češće od svakih 5-7 godina i lokalizirani su uglavnom u sjevernoj Tasmaniji i središnjoj Viktoriji. S tim u vezi, publikacije posvećene proučavanju strukture australijske populacije P. infestans praktično odsutne. Najnovije dostupne informacije su iz 1998-2000. (Drenth i dr., 2002). Prema autorima, stanovništvo države Victoria bila je klonska linija US-1.3, što je indirektno potvrdilo migraciju ovog genotipa iz Sjedinjenih Država. Tasmanski uzorci identificirani su kao tip AU-3, različiti od genotipova koji su u to vrijeme bili prisutni u drugim dijelovima svijeta.
Karakteristike razvoja kasne bolesti u Rusiji
U Europi se infekcija unesena bolesnim sjemenskim gomoljima, oosporama koje su prezimile u tlu, kao i zoosporangijama koje je vjetar donio iz biljaka uzgojenih iz prezimljenih gomolja na prošlogodišnjim poljima (biljke "dobrovoljci") ili na gomilama oljuštenih, smatraju se primarnim inokulumom na krompiru. oznaka za skladištenje gomolja. Od toga se biljke uzgajane na gomilama odbačenih gomolja smatraju najopasnijim izvorom zaraze. tamo je broj proklijalih gomolja često značajan i zoosporangije se iz njih mogu prenositi na velike udaljenosti. Ostali izvori (oospore, "dobrovoljne" biljke) nisu toliko opasni, jer nije uobičajeno da se biljke na istim poljima uzgajaju češće od jednom u 3-4 godine. Infekcija bolesnim sjemenskim gomoljima takođe je minimalna zbog dobrog sistema kontrole kvaliteta semena.
Generalno, količina inokuluma u evropskim populacijama je ograničena, pa je stoga porast epidemije prilično spor i može se uspješno kontrolirati kemijskim fungicidima. Glavni zadatak u evropskim uvjetima je borba protiv infekcije u fazi kada započinje masovno širenje zoosporangija iz pogođenih biljaka.
U Rusiji je situacija radikalno drugačija. Većina usjeva krompira i paradajza uzgaja se u malim privatnim vrtovima; zaštitne mjere se na njima ili ne provode ili se fungicidni tretmani provode u nedovoljnom broju i započinju nakon pojave kasne mrlje na vrhovima. Kao rezultat toga, privatni povrtnjaci djeluju kao glavni izvor zaraze iz koje se zoosporangije vjetrom prenose na komercijalne zasade. To potvrđuju naša izravna zapažanja u regijama Moskva, Brjansk, Kostroma, Rjazanj: oštećenja biljaka u privatnim vrtovima uočavaju se i prije početka fungicidnog tretmana komercijalnih zasada. Nakon toga, epidemija na velikim poljima suzbija se upotrebom fungicidnih preparata, dok se u privatnim vrtovima brzo razvija kasna bolest.
U slučaju pogrešne ili „proračunske“ obrade komercijalnih zasada, na poljima se pojavljuju žarišta kasne bolesti. nakon toga se aktivno razvijaju, pokrivajući sve veća područja (Elansky, 2015). Infekcija u privatnim vrtovima ima značajan utjecaj na epidemije na komercijalnim poljima. U svim regionima uzgajanja krompira u Rusiji površina koju zauzima krompir u privatnim vrtovima nekoliko je puta veća od ukupne površine polja velikih proizvođača. U takvom okruženju privatni povrtnjaci mogu se smatrati globalnim resursom inokuluma za komercijalna polja. Pokušajmo identificirati ona svojstva koja su karakteristična za genotipove sojeva u privatnim vrtovima.
Sadnja nesemenskih i karantinskih kontrola suvog krompira, semena paradajza dobijenih od sumnjivih stranih proizvođača, dugotrajni uzgoj krompira i paradajza na istim površinama, nepravilan tretman fungicidima ili njihovo potpuno odsustvo dovode do ozbiljnih epifitoza u privatnom sektoru, čiji je rezultat besplatan ukrštanje, hibridizacija i stvaranje oospora u privatnim vrtovima. Kao rezultat, uočava se vrlo velika genotipska raznolikost patogena, kada je gotovo svaki soj jedinstven po svom genotipu (Elansky i sur., 2001., 2015). Sadnjom sjemenskog krompira različitog genetskog porijekla malo je vjerovatno da će se pojaviti klonske linije specijalizirane za napad na određenu sortu. Odabrani sojevi u takvom slučaju razlikuju se po svojoj svestranosti u odnosu na pogođene sorte, većina njih ima blizu maksimalnog broja gena virulencije. To se vrlo razlikuje od sistema "klonskih linija" tipičnog za velika polja poljoprivrednih preduzeća sa pravilno instaliranim sistemom zaštite od kasne bolesti. "Klonske linije" (kada su svi sojevi patogena kasne bolesti na terenu zastupljeni jednim ili više genotipova) sveprisutni su u zemljama u kojima se uzgoj krumpira obavlja isključivo na velikim farmama: SAD, Holandija, Danska itd. U Engleskoj, Irskoj, Poljskoj, gdje su parcele domaćinstava takođe tradicionalno raširene uzgoj krumpira, veća je i genotipska raznolikost u privatnim vrtovima. Krajem 20. vijeka, "klonske linije" bile su široko rasprostranjene u azijskim i dalekoistočnim dijelovima Rusije (Elansky i sur., 2001.), što je očito posljedica upotrebe istih sorti krompira isključivo za sadnju. Nedavno se situacija u tim regijama takođe počela mijenjati prema povećanju genotipske raznolikosti populacija.
Nedostatak intenzivnih tretmana fungicidnim preparatima ima još jednu, izravnu posljedicu - u vrtovima nema nakupljanja rezistentnih sojeva. Doista, naši rezultati pokazuju da se sojevi otporni na metalaksil nalaze znatno rjeđe u privatnim vrtovima nego u komercijalnim zasadima.
Neposredna blizina zasada krompira i paradajza, tipična za privatne vrtove, olakšava migraciju sojeva između ovih kultura, što je rezultiralo time da je u posljednjoj deceniji među sojevima izoliranim od krumpira udio sojeva koji nose gen za rezistenciju na sorte čeri paradajza (T1), prethodno karakterističan samo za " paradajz "sojevi. Sojevi sa genom T1 u većini su slučajeva vrlo agresivni i prema krompiru i paradajzu.
Posljednjih godina kasna bolest na paradajzu počela se pojavljivati u mnogim slučajevima ranije nego na krompiru. Sadnice rajčice mogu biti zaražene oosporama u tlu ili oosporama prisutnim u sjemenkama paradajza ili prilijepljenim uz njih (Rubin i sur., 2001). U posljednjih 15 godina u trgovinama se pojavio veliki broj jeftinog pakiranog sjemena, uglavnom iz uvoza, a većina malih proizvođača prešla je na upotrebu. Sjeme može sadržavati sojeve s genotipovima tipičnim za regije njihovog uzgoja. U budućnosti su ovi genotipovi uključeni u seksualni proces u privatnim vrtovima, što dovodi do pojave potpuno novih genotipova.
Stoga se može reći da su privatni vrtovi globalni "topionik" u kojem se, kao rezultat razmjene genetskog materijala, obrađuju postojeći genotipovi i pojavljuju se potpuno novi. Štoviše, njihov se odabir odvija u uvjetima koji se vrlo razlikuju od onih stvorenih za krumpir na velikim farmama: odsutnost fungicidne preše, sortna ujednačenost zasada, prevladavanje biljaka pogođenih različitim oblicima virusne i bakterijske infekcije, blizina rajčice i divljih noćnih sjena, aktivno ukrštanje i stvaranje oospora, mogućnost da oospore djeluju kao izvor zaraze u narednih godinu dana.
Sve ovo dovodi do vrlo visoke genotipske raznolikosti populacija dvorišta. U uvjetima epifitoze u povrtnjacima, kasna bolest se vrlo brzo širi i oslobađaju se ogromne količine spora, leteći do obližnjih komercijalnih zasada. Međutim, nakon što su u komercijalna polja ušli s ispravnim sistemom poljoprivredne tehnologije i hemijske zaštite, pristigle spore praktički nemaju priliku pokrenuti epifitotiku na terenu, što je zbog odsustva klonskih linija koje su otporne na fungicide i specijalizovane za uzgajanu sortu.
Drugi izvor primarnog inokuluma mogu biti bolesni gomolji zarobljeni u komercijalnim sadnicama. Ovi gomolji uzgajani su u pravilu na poljima sa dobrom poljoprivrednom tehnologijom i intenzivnom hemijskom zaštitom. Genotipovi izolata koji su utjecali na gomolje prilagođeni su razvoju vlastite sorte. Ovi sojevi su znatno opasniji za komercijalnu sadnju od inokuluma porijeklom iz privatnih vrtova. Rezultati naših studija takođe podržavaju ovu pretpostavku. Populacije izolirane sa velikih polja s pravilno provedenom hemijskom zaštitom i dobrom poljoprivrednom tehnologijom ne razlikuju se u velikoj genotipskoj raznolikosti. Često je to nekoliko klonskih linija koje su vrlo agresivne.
Sojevi komercijalnog sjemenskog materijala mogu ući u populacije u povrtnjacima i biti uključeni u procese koji se u njima odvijaju. Međutim, u povrtnjaku će njihova konkurentnost biti znatno niža nego na komercijalnom polju, a uskoro će prestati postojati u obliku klonske linije, ali njihovi geni mogu se koristiti u populaciji „bašte“.
Infekcija koja se razvije na "dobrovoljnim" biljkama i na gomilama izljuštenih krtola tokom berbe nije toliko relevantna za Rusiju, jer U glavnim regionima uzgajanja krompira u Rusiji primećuje se duboko zimsko smrzavanje tla, a biljke iz krtola koje su prezimile u tlu retko se razvijaju. Štoviše, kao što pokazuju naši eksperimenti, patogen kasne plamenje ne preživljava na negativnim temperaturama čak ni na gomoljima koji su zadržali svoju održivost. U sušnoj zoni, u kojoj se vrši uzgoj ranog krompira, kasna bolest je prilično rijetka zbog suhe i vruće sezone rasta.
Dakle, trenutno promatramo podjelu populacija P. infestans na populacije „poljske“ i „vrtne“. Međutim, posljednjih godina primijećeni su procesi koji su doveli do konvergencije i međusobnog prodiranja genotipova iz ovih populacija.
Među njima se može primijetiti općenito povećanje pismenosti malih proizvođača, pojava pristupačnih malih pakovanja sjemenskog krompira, širenje fungicidnih pripravaka u malim pakiranjima i gubitak straha od „hemije“ stanovništva.
Situacije nastaju kada su, zahvaljujući snažnoj aktivnosti jednog dobavljača, čitava sela zasađena gomoljima sjemena iste sorte i opskrbljena malim pakovanjima istih pesticida. Može se pretpostaviti da će se krumpir iste sorte naći na komercijalnim zasadima u blizini.
S druge strane, neke kompanije za trgovinu pesticidima promoviraju "proračunske" šeme hemijskog tretmana. U ovom se slučaju podcjenjuje broj preporučenih tretmana i nude se najjeftiniji fungicidi, a naglasak nije na sprječavanju razvoja kasne bolesti do košenja vrhova, već na određenom kašnjenju epifitoze u cilju povećanja prinosa. Takve sheme su ekonomski opravdane kada se uzgaja krompir za povrće od sjemenskog materijala niske kvalitete, kada u principu ne dolazi u obzir postizanje visokog prinosa. Međutim, u ovom slučaju, za razliku od vrtnih populacija, izravnana genetska podloga krompira doprinosi odabiru specifičnih fizioloških rasa koje su vrlo opasne za ovu sortu.
Generalno, tendencije ka približavanju „vrtnih“ i „poljskih“ metoda proizvodnje krompira čine nam se prilično opasnima. Kako bi se spriječile njihove negativne posljedice, kako u kućnom, tako i u komercijalnom sektoru, bit će potrebno kontrolirati i sortiment sjemenskog krumpira i paletu fungicida koji se nude privatnim vlasnicima u maloj ambalaži, kao i traganje za shemama zaštite krumpira i upotrebom fungicida u komercijalnom sektoru.
U područjima privatnog sektora intenzivno se razvija ne samo kasna bolest, već i Alternaria. Većina vlasnika privatnih parcela ne poduzima posebne mjere za zaštitu od Alternarije, zamjenjujući razvoj Alternarije za prirodno uvenuće vrhova ili razvoj kasne bolesti. Stoga, s masovnim razvojem Alternarije na osjetljivim sortama, parcele u domaćinstvu mogu poslužiti kao izvor inokuluma za komercijalne sadnje.
Mehanizmi varijabilnosti
Proces mutacije
Budući da je pojava mutacija slučajan proces koji se odvija s malom učestalošću, pojava mutacija na bilo kojem lokusu ovisi o učestalosti mutacije ovog lokusa i veličini populacije. Kada se proučava učestalost mutacija sojeva P. infestans, obično se određuje broj kolonija uzgajanih na selektivnim hranjivim podlogama nakon tretmana hemijskim ili fizičkim mutagenima. Kao što se može vidjeti iz podataka predstavljenih u Tabeli 8, učestalost mutacije istog soja na različitim lokusima može se razlikovati za nekoliko redova veličine. Velika učestalost mutacija rezistencije na metalaksil može biti jedan od razloga akumulacije sojeva otpornih na njega u prirodi.
Učestalost spontanih ili indukovanih mutacija, izračunata na osnovu laboratorijskih eksperimenata, ne odgovara uvijek procesima koji se javljaju u prirodnim populacijama iz sljedećih razloga:
1. Kod asinkronih nuklearnih fisija nemoguće je procijeniti učestalost mutacija po jednoj nuklearnoj generaciji. Stoga većina eksperimenata pruža informacije samo izravno o učestalosti mutacija, bez razlikovanja između dva mutacijska događaja i jednog događaja nakon mitoze.
2. Mutacije u jednom koraku obično smanjuju ravnotežu genoma, pa se, zajedno sa stjecanjem novog svojstva, smanjuje i opšta kondicija organizma. Većina eksperimentalno dobijenih mutacija ima smanjenu agresivnost i nije zabilježena u prirodnim populacijama. Dakle, koeficijent korelacije između stepena otpornosti mutanata P. infestans na fungicide fenilamida i brzine rasta u umjetnom okruženju bio je u prosjeku (-0,62), a otpornosti na fungicide i agresivnost na lišću krumpira (-0,65) (Derevyagina i sur. , 1993), što ukazuje na nisku sposobnost mutanata. Mutacije u otpornosti na dimetomorf takođe su praćene naglim smanjenjem vitalnosti (Bagirova i sar., 2001).
3. Većina spontanih i induciranih mutacija recesivne su i ne pokazuju se fenotipski u eksperimentima, već predstavljaju skrivenu rezervu varijabilnosti u prirodnim populacijama. Mutirani sojevi izolirani u laboratorijskim eksperimentima nose dominantne ili poludominantne mutacije (Kulish i Dyakov, 1979). Očigledno, nuklearna diploidija objašnjava neuspješne pokušaje dobijanja mutanata pod utjecajem UV zračenja koji su virulentni na prethodno otporne sorte (McKee, 1969). Prema autorovim proračunima, takve mutacije mogu se javiti s frekvencijom manjom od 1: 500000 XNUMX. Prijelaz recesivnih mutacija u homozigotno, fenotipski izraženo stanje može se dogoditi zbog seksualne ili aseksualne rekombinacije (vidi dolje). Međutim, čak i u ovom slučaju, mutacija se može prikriti dominantnim alelima jezgara divljeg tipa u cenotičnom (višejedrnom) miceliju i fenotipski fiksirati samo tijekom stvaranja mononuklearnih zoospora.
Tabela 8. Učestalost mutacija P. infestans supstancama koje inhibiraju rast pod dejstvom nitrosometiluree (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova i sar., 2001)
Složeni | Učestalost mutacije |
Oksitetraciklin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomicin | 8,3 x10-8 |
Trihotecin | 1,8 10 x-8 |
Cikloheksimid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Veličine populacije takođe igraju odlučujuću ulogu u nastanku spontanih mutacija. U vrlo velikim populacijama, u kojima je broj ćelija N> 1 / a, gdje je a stopa mutacije, mutacija prestaje biti slučajan fenomen (Kvitko, 1974).
Proračuni pokazuju da se s prosječnom najezdom polja krompira (35 mjesta po biljci) dnevno na jednom hektaru stvori 8x1012 spora (Dyakov i Suprun, 1984). Izgleda da takve populacije sadrže sve mutacije dopuštene tipom razmjene na svakom lokusu. Čak će i rijetku mutaciju, koja se javlja s frekvencijom 10-9, steći hiljadu jedinki od miliona koji žive na jednom hektaru polja krompira. Za mutacije koje se javljaju s većom učestalošću (na primjer, 10-6), u takvoj populaciji mogu se svakodnevno pojaviti različite uparene mutacije (istovremeno na dva lokusa), tj. postupak mutacije zamijenit će rekombinaciju.
Migracije
Za P. infestans poznate su dvije glavne vrste migracije: približavanje udaljenosti (unutar polja krompira ili susjednih polja) širenjem zoosporangije zračnim strujama ili prskanjem kiše i na velike udaljenosti - sadnjom krtola ili prevezenim plodovima paradajza. Prva metoda omogućava širenje fokusa bolesti, druga - stvaranje novih žarišta na mjestima udaljenim od primarne.
Širenje infekcije gomoljima i voćem paradajza ne samo da doprinosi nastanku bolesti na novim mjestima, već je i glavni izvor genetske raznolikosti u populacijama. U Moskovskoj regiji uzgaja se krompir doveden iz različitih regiona Rusije i zapadne Evrope. Plodovi paradajza donose se iz južnih regiona Rusije (Astrahanska oblast, Krasnodarski kraj, Severni Kavkaz). Sjeme paradajza, koje također može poslužiti kao izvor zaraze (Rubin i sar., 2001), također se uvozi iz južnih regija Rusije, Kine, evropskih zemalja i drugih zemalja.
Prema proračunima E. Mayr (1974), genetske promjene u lokalnoj populaciji uzrokovane mutacijama rijetko prelaze 10-5 po lokusu, dok u otvorenim populacijama razmjena zbog proticaja gena iznosi najmanje 10-3 - 10-4.
Migracija zaraženih gomolja odgovorna je za ulazak P. infestans u Evropu, šireći se u sve regije svijeta u kojima se uzgaja krompir; izazvale su najozbiljnije promjene stanovništva. Kasna mrlja na krompiru pojavila se na teritoriji Ruskog carstva gotovo istovremeno sa pojavom u zapadnoj Evropi.
Budući da je bolest prvi put zabilježena 1846.-1847. U baltičkim državama, a tek narednih godina proširila se u Bjelorusiji i sjeverozapadnim regijama Rusije, očito je njeno zapadnoevropsko porijeklo. Prvi izvor kasne mrlje u Starom svijetu nije toliko očit. Hipoteza koju su razvili Fry i suradnici (Fry i suradnici, 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin i ostali, 1994) sugerira da je parazit prvo došao iz Meksika u Sjevernu Ameriku, gdje se proširio preko usjeva, a zatim je prevezen u zapadnu Europu (slika 7).
Kao rezultat ponovljenog zanošenja (dvostruki efekt "uskog grla"), pojedinačni klonovi su stigli u Europu, čiji su potomci izazvali pandemiju na cijeloj teritoriji Starog svijeta na kojoj se uzgaja krompir. Kao dokaz za ovu hipotezu autori navode, prvo, sveprisutnu pojavu samo jedne vrste parenja (A1) i, drugo, homogenost genotipova ispitivanih sojeva iz različitih regija (svi se temelje na molekularnim markerima, uključujući 2 izozimska lokusa, uzorke DNK uzimanja otisaka i struktura mitohondrijske DNK je identična i odgovara klonu US-1 opisanom u SAD-u). Međutim, neki podaci izazivaju sumnju barem u neke od odredbi navedene hipoteze. Analiza mitohondrijske DNK P. infestans izolirane iz herbarijskih uzoraka krompira zaraženih tokom prvog epifitotskog perioda 40-ih pokazala je da se oni razlikuju u strukturi mitohondrijske DNK iz klona US-1, koji je, prema tome, bio nije jedini izvor zaraze u Evropi (Ristaino i sur, 2001).
Situacija sa kasnom bolešću ponovo se pogoršala 80-ih godina XX vijeka. Dogodile su se sljedeće promjene:
1) Povećana je prosječna agresivnost populacije, što je posebno dovelo do širenja najštetnijeg oblika kasne bolesti - oštećenja peteljki i stabljika.
2) Došlo je do pomaka u vremenu kasne mrlje na krompiru - od kraja jula do početka jula, pa čak i do kraja juna.
3) Tip parenja A2, koji ranije nije bio prisutan u Starom svijetu, postao je sveprisutan.
Promjenama su prethodila dva događaja: masovna upotreba novog fungicida metalaksila (Schwinn i Staub, 1980) i pojava Meksika kao svjetskog izvoznika krompira (Niederhauser, 1993). U skladu s tim, istaknuta su dva razloga za promjenu populacije: konverzija tipa parenja pod utjecajem metalaksila (Ko, 1994) i masovno unošenje novih sojeva zaraženim gomoljima iz Meksika (Fry i Goodwin, 1995). Iako je interkonverzije tipova parenja pod uticajem metalaksila dobio ne samo Ko, već i u radovima izvedenim u laboratoriju Moskovskog državnog univerziteta (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), druga hipoteza je poželjnija. Zajedno s pojavom drugog tipa parenja, dogodile su se ozbiljne promjene u genotipovima ruskih sojeva P. infestans, uključujući neutralne gene (izo enzim i RFLP lokusi), kao i u strukturi mitohondrijske DNK. Kompleks ovih promjena ne može se objasniti djelovanjem metalaksila, već je došlo do masovnog uvoza novih sojeva iz Meksika, koji su, kao agresivniji (Kato i sur., 1997.), raselili stare sojeve (US-1), postajući dominantni u populacijama. Promjena u sastavu evropskog stanovništva dogodila se u vrlo kratkom vremenu - od 1980. do 1985. (Fry i dr., 1992). Na teritoriji bivšeg SSSR-a pronađeni su „novi sojevi“ u kolekcijama iz Estonije 1985. godine, odnosno ranije nego u Poljskoj i Njemačkoj (Goodwin et al., 1994). Poslednji put kada je „stari soj US-1“ u Rusiji izolovan iz zaraženog paradajza u Moskovskoj regiji 1993. godine (Dolgova i sar., 1997). Također u Francuskoj, „stari“ sojevi pronađeni su u zasadima paradajza sve do ranih 90-ih, odnosno nakon što su dugo nestali na krompiru (Leberton i Andrivon, 1998). Promjene u sojevima P. infestans utjecale su na mnoge osobine, uključujući one od velike praktične važnosti, i povećale štetnost kasne bolesti.
Seksualna rekombinacija
Da bi seksualna rekombinacija doprinijela varijabilnosti, potrebno je, prvo, prisustvo dvije vrste parenja u populaciji u omjeru bliskom 1: 1, i, drugo, prisustvo početne varijabilnosti populacije.
Odnos tipova parenja uvelike varira u različitim populacijama, pa čak iu različitim godinama u jednoj populaciji (Tabela 9,10, 90). Razlozi za tako drastične promjene u učestalosti tipova parenja u populacijama (kao, na primjer, u Rusiji ili Izraelu početkom 2002-ih godina prošlog stoljeća) nisu poznati, ali vjeruje se da je to posljedica uvođenja konkurentnijih klonova (Cohen, XNUMX).
Neki indirektni podaci ukazuju na tok seksualnog procesa u određenim godinama i u određenim regijama:
1) Studije populacija iz moskovske regije pokazale su da je u 13 populacija u kojima je udio tipa parenja A2 manji od 10%, ukupna genetska raznolikost izračunata za tri izozimska lokusa bila 0,08, a u 14 populacija u kojima je udio A2 premašio 30%, genetska raznolikost bila je dvostruko veća (0,15) (Elansky i sar., 1999). Dakle, što je veća vjerovatnoća seksualnog odnosa, to je veća genetska raznolikost populacije.
2) Veza između omjera tipova parenja u populacijama i intenziteta stvaranja oospora primijećena je u Izraelu (Cohen et al., 1997) i u Holandiji
(Flier i dr., 2004.). Naše studije su pokazale da su u populacijama u kojima su izolati s tipom parenja A2 činili 62, 17, 9 i 6%, oospore pronađene u 78, 50, 30 i 15% analiziranih listova krompira (koji imaju 2 ili više mrlja).
Uzorci s 2 ili više mrlja znatno češće sadrže oospore od uzoraka s 1 mrljom (32, odnosno 14% uzoraka) (Apryshko et al., 2004).
Oospore su bile mnogo češće u lišću srednjeg i donjeg sloja biljke krumpira (Mytsa i sar., 2015; Elansky i sar., 2016).
3) U nekim regijama otkriveni su jedinstveni genotipovi čija je pojava povezana sa seksualnom rekombinacijom. Tako su u Poljskoj 1989. i Francuskoj 1990. sojevi homozigotni za glukozu-6-
fosfat izomeraza (GPI 90/90). Budući da se prethodno 10 godina susretalo samo 90/100 heterozigota, homozigotnost se pripisuje spolnoj rekombinaciji (Sujkowski i sur., 1994). U Kolumbiji (SAD) su izolati koji kombiniraju A2 sa GPI 100/110 i A1 s GPI 100/100 česti, međutim, na kraju sezone 1994. (16. avgusta i 9. septembra), sojevi s rekombinantnim genotipovima (A1 GPI 100/110 i A2 GPI 100/100) (Miller i dr., 1997).
4) U nekim populacijama iz Poljske (Sujkowski i sur., 1994.) i Sjevernog Kavkaza (Amatkhanova i sur., 2004.), raspodjela DNK lokusa otiska prsta i alozimskih proteinskih lokusa odgovara distribuciji Hardy-Weinberga, što ukazuje
o visokom udjelu doprinosa seksualne rekombinacije varijabilnosti populacija. U drugim regijama Rusije nije pronađena podudarnost s distribucijom Hardy-Weinberga u populacijama, ali je pokazano prisustvo neravnoteže veza, što ukazuje na prevladavanje klonske reprodukcije (Elansky et al., 1999).
5) Genetska raznolikost (GST) između sojeva s različitim tipovima parenja (A1 i A2) bila je niža nego kod različitih populacija (Sujkowski i sur., 1994), što indirektno ukazuje na spolne križanja.
Istovremeno, doprinos seksualne rekombinacije raznolikosti populacije ne može biti vrlo visok. Ovaj doprinos izračunat je za populacije Moskovske regije (Elansky i sar., 1999). Prema proračunima Lewontina (1979) „rekombinacija, koja može proizvesti nove varijante iz dva lokusa s frekvencijom koja ne prelazi umnožak njihovih heterozigotnosti, postaje efikasna samo ako su vrijednosti heterozigotnosti za oba alela već visoke“.
Uz omjer dvije vrste uparivanja, koji je tipičan za Moskovsku regiju, jednak 4: 1, frekvencija rekombinacije bit će 0,25. Vjerovatnoća da će ukršteni sojevi biti heterozigotni za dva od tri proučena lokusa izozima u proučavanim populacijama bila je 0,01 (2 soja od 177). Shodno tome, verovatnoća pojave dvostrukih heterozigota kao rezultat rekombinacije ne bi trebalo da prelazi njihov proizvod pomnožen sa verovatnoćom ukrštanja (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tj. seksualni rekombinanti obično ne spadaju u ispitivani uzorak sojeva. Ovi proračuni su napravljeni za populacije iz moskovskog regiona koje karakteriše relativno velika varijabilnost. U monomorfnim populacijama poput sibirskih, seksualni proces, čak i ako se javlja u pojedinim populacijama, ne može utjecati na njihovu genetsku raznolikost.
Pored toga, P. infestans karakterizira česta neusklađenost hromozoma u mejozi, što dovodi do aneuploidije (Carter i sur., 1999). Takva kršenja smanjuju plodnost hibrida.
Paraseksualna rekombinacija, mitotska konverzija gena
U eksperimentima na fuziji sojeva P. infestans sa mutacijama otpornosti na različite inhibitore rasta utvrđena je pojava mizolata rezistentnih na oba inhibitora (Shattock i Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Sojevi otporni na dva inhibitora rasta nastali su kao rezultat heterokariotizacije micelija i u ovom slučaju su se cijepili tijekom reprodukcije mononuklearnim zoosporama (Judelson, Ge Yang, 1998), ili nisu cjepili u potomstvu monozoospora, jer su imali tetraploidne (jer su početni izolati diploidni) jezgra (K , 1979). Heterozigotni diploidi segregirali su se na vrlo maloj frekvenciji zbog haploidizacije, nedisjunkcije hromozoma i mitotskog ukrštanja (Poedinok i sur., 1982). Učestalost ovih procesa mogla bi se povećati uz pomoć određenih radnji na heterozigotne diploide (na primjer, UV zračenje klijavih spora).
Iako se stvaranje vegetativnih hibrida s dvostrukom rezistencijom događa ne samo in vitro, već i u gomoljima krompira zaraženim smjesom mutanata (Kulish i sur., 1978), prilično je teško procijeniti ulogu paraseksualne rekombinacije u stvaranju novih genotipova u populacijama. Učestalost stvaranja segregana zbog haploidizacije, nedisjukcije hromozoma i mitotskog ukrštanja bez posebnih efekata je zanemariva (manje od 10-3).
Pojava homozigotnih segregana heterozigotnih sojeva može se temeljiti i na mitotičkom ukrštanju i na mitotičkoj konverziji gena, koja se kod P. sojae javlja s frekvencijom od 3 x 10-2 do 5 x 10-5 po lokusu, ovisno o soju (Chamnanpunt et al. , 2001.).
Iako se pokazalo da je učestalost pojave heterokariona i heterozigotnih diploida neočekivano velika (dostižući desetke posto), taj se proces događa samo kada se spoje mutirane kulture dobivene iz istog soja. Kada se koriste različiti sojevi izolirani iz prirode, heterokariotizacija se ne događa (ili se javlja s vrlo malom frekvencijom) zbog prisustva vegetativne nekompatibilnosti (Poedinok i Dyakov, 1981; Anikina i sur., 1997b; Cherepennikova-Anikina i sur., 2002). Shodno tome, uloga paraseksualne rekombinacije može se svesti samo na intraklonalnu rekombinaciju u heterozigotnim jezgrima i prelazak pojedinačnih gena u homozigotno stanje bez seksualnog procesa. Ovaj proces može biti od epidemiološkog značaja kod sojeva s recesivnim ili poludominantnim mutacijama rezistencije na fungicide. Njegov prelazak u homozigotno stanje zbog paraseksualnog procesa povećat će otpor nosača mutacije (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresija gena
Heterotalne vrste Phytophthora sposobne su za križanje sa stvaranjem hibridnih oospora (vidi Vorob'eva i Gridnev, 1983; Sansome i sur., 1991; Veld i sur., 1998). Prirodni hibrid dviju vrsta Phytophthora bio je toliko agresivan da je ubio hiljade joha u Velikoj Britaniji (Brasier et al., 1999). P. infestans može se pojaviti s drugim vrstama roda (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, itd.) Na uobičajenim biljkama domaćinu i u tlu, ali u literaturi je malo podataka o mogućnosti interspecifičnih hibrida. U laboratorijskim uvjetima dobiveni su hibridi između P. infestans i P. Mirabilis (Goodwin i Fry, 1994).
Tabela 9. Udeo sojeva P. infestans sa tipom parenja A2 u različitim zemljama sveta u periodu od 1990. do 2000. (prema podacima otvorenih literaturnih izvora i sajtova www.euroblight.net, www.eucablight.org)
zemlja | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bjelorusija | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgija | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Эквадор | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonija | 8 (12) | ||||||||||
Engleska | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Финляндия | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francuska | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Madžarska | 72 (32) | ||||||||||
Irska | 4 (145) | ||||||||||
Sjever. Irska | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holandija | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Перу | 0 (34, 1984.-86.) | 0 (287, 1997.-98.) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Poljska | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Škotska | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Švedska | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Koreja | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kina | 20 (142, 1995.-98.) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Колумбия | 0 (40, 1994.-2000.) | ||||||||||
Urugvaj | 100 (25, 1998.-99.) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997.-2000.) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Srbija | 76 (37) | ||||||||||
Meksiko (Toluca) | 28 (292, 1988.-89.) | 50 (389, 1997.-98.) |
Tabela 10. Udio sojeva P. infestans sa tipom parenja A2 u različitim zemljama svijeta u periodu od 2000. do 2011. godine
zemlja | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austrija | 65 (83) | ||||||||||
Bjelorusija | 42 (78) | ||||||||||
Belgija | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Швейцария | 89 (19) | ||||||||||
Češka | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Njemačka | 95 (53) | ||||||||||
Danska | 48 (52) | ||||||||||
Эквадор | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonija | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Engleska | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Финляндия | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francuska | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Madžarska | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Sjever. Irska | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holandija | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Перу | 0 (36) | ||||||||||
Poljska | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Škotska | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Švedska | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Словакия | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Koreja | 46 (26) | ||||||||||
Brazil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Вьетнам | 0 (294, 2003.-04.) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamika genotipskog sastava populacija
Promjene u genotipskom sastavu populacija P. infestans mogu se dogoditi pod utjecajem migracije novih klonova iz drugih regija, poljoprivredne prakse (promjena sorti, primjena fungicida) i vremenskih prilika. Vanjski utjecaji različito utječu na klonove u različitim fazama životnog ciklusa, stoga populacije godišnje doživljavaju ciklične promjene u frekvencijama gena koji su predmet selekcije, uslijed promjene u prevladavajućoj ulozi pomicanja i selekcije gena.
Uticaj sorte
Nove sorte sa efikasnim genima za vertikalnu rezistenciju (R-geni) snažni su selektivni faktor, odabirući klonove sa komplementarnim genima virulencije u populacijama P. infestans. U nedostatku nespecifične rezistencije u sorti krompira, koja inhibira rast populacije patogena, proces zamjene dominantnih klonova u populaciji događa se vrlo brzo. Dakle, nakon širenja sorte Domodedovsky u regiji Moskve, koja ima gen za rezistenciju R3, učestalost klonova virulentnih za ovu sortu porasla je sa 0,2 na 0,82 u jednoj godini (Dyakov i Derevjagina, 2000).
Međutim, promjena učestalosti gena virulencije (patotipova) u populacijama događa se ne samo pod utjecajem uzgajanih sorti krompira. Na primjer, u Bjelorusiji su do 1977. godine dominirali klonovi s genima virulencije 1 i 4, što je bilo uzrokovano uzgojem sorti krompira s genima rezistencije R1 i R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Međutim, krajem 70-ih godina XX. Stoljeća pojavili su se klonovi s različitim genima virulencije i njihovim kombinacijama, a komplementarni geni otpora nikada nisu korišteni u uzgoju krumpira (ekstra virulencijski geni) (Ivanyuk et al., 2002). Razlog za pojavu takvih klonova očito je posljedica migracije u Europu zaraznog materijala iz Meksika gomoljima krompira. U svojoj domovini ti su se klonovi razvili ne samo na uzgajanom krompiru, već i na divljim vrstama koje nose razne gene otpornosti, pa je kombinacija mnogih gena virulencije u genom bila neophodna za preživljavanje u tim uvjetima.
Što se tiče sorti sa nespecifičnom rezistencijom, one smanjenjem brzine reprodukcije patogena usporavaju evoluciju njegovih populacija, što je, kao što je već spomenuto, funkcija broja. Budući da je agresivnost poligena, klonovi koji sadrže veći broj gena za "agresivnost" akumuliraju se što je prije veća populacija. Stoga visoko agresivne rase nisu proizvod prilagodbe uzgajanim sortama nespecifične otpornosti, već je, naprotiv, vjerojatnije da će ih se otkriti u zasadima vrlo osjetljivih sorti koje su akumulatori spora parazita.
Tako su u Rusiji najagresivnije populacije P. Infestana pronađene u zonama godišnjih epifitotija (populacije iz Sahalina, Lenjingrada i Brjanske oblasti). Ispostavilo se da je agresivnost ove populacije viša od meksičke (Filippov i sur., 2004).
Uz to, u listovima rezistentnih sorti stvara se manje oospora nego u osjetljivih (Hanson i Shattock, 1998), odnosno nespecifična rezistencija sorte također smanjuje sposobnosti rekombinacije parazita i mogućnost alternativnih metoda zimovanja.
Uticaj fungicida
Fungicidi ne samo da smanjuju broj fitopatogenih gljivica, tj. utječu na kvantitativne karakteristike njihovih populacija, ali također mogu promijeniti učestalost pojedinih genotipova, tj. utjecati na kvalitativni sastav populacija. Među najvažnijim pokazateljima populacija koje se mijenjaju pod uticajem fungicida su sljedeći: promjene u otpornosti na fungicide, promjene u agresivnosti i virulenciji i promjene u sistemima uzgoja.
Uticaj fungicida na otpornost i agresivnost populacija
Stupanj ovog uticaja određuje se prije svega vrstom korištenog fungicida, koji se uslovno može podijeliti na polisit, oligosit i monosit.
Prvi uključuje većinu kontaktnih fungicida. Otpor prema njima (ako je to uopće moguće) kontrolira veliki broj vrlo slabo ekspresivnih gena. Ova svojstva određuju odsustvo vidljivih promjena u rezistenciji stanovništva nakon tretmana fungicidima (iako je u nekim eksperimentima postignuto određeno povećanje rezistencije). Populacija gljiva sačuvana nakon prskanja kontaktnim fungicidima sastoji se od dvije skupine sojeva:
1) Sojevi očuvani na područjima biljaka koji nisu tretirani lijekom. Budući da nije bilo kontakta s fungicidom, agresivnost i otpornost ovih sojeva se ne mijenjaju.
2) Sojevi u kontaktu s fungicidom čija je koncentracija na dodirnim mjestima bila niža od smrtonosne. Kao što je gore spomenuto, rezistencija ovog dijela populacije također se ne mijenja, međutim, zbog djelomičnog štetnog učinka fungicida čak i u koncentraciji subletala na metabolizam gljivične stanice, opću kondiciju i njezinu parazitsku komponentu, agresivnost, smanjenje (Derevyagina i Dyakov, 1990).
Dakle, čak i dio populacije koji nije umro, izložen kontaktu s fungicidom, ima slabu agresivnost i ne može biti izvor epifitotika. Stoga je pažljiva obrada, koja smanjuje učestalost udjela populacije koja nije u kontaktu s fungicidom, uvjet za uspjeh zaštitnih mjera. Otpornost na oligositne fungicide kontrolira nekoliko aditivnih gena.
Mutacija svakog gena dovodi do određenog povećanja rezistencije, a ukupni stepen rezistencije je posljedica dodavanja takvih mutacija. Stoga se povećanje otpora događa postepeno. Primjer postepenog povećanja otpornosti su mutacije otpornosti na fungicid dimetomorf, koji se široko koristi za zaštitu krompira od kasne bolesti. Otpornost na dimetomorf je poligenska i aditivna. Mutacija u jednom koraku blago povećava otpor.
Svaka sljedeća mutacija smanjuje ciljnu veličinu i, posljedično, učestalost sljedećih mutacija (Bagirova i sur., 2001). Povećanje prosječne rezistencije populacije nakon ponovljenih tretmana oligositnim fungicidom događa se postepeno i postepeno. Brzinu ovog procesa određuju najmanje tri čimbenika: učestalost mutacije gena rezistencije, koeficijent rezistencije (odnos smrtonosne doze rezistentnog soja u odnosu na osjetljivi) i učinak mutacija gena rezistencije na kondiciju.
Učestalost pojave svake naredne mutacije manja je od prethodne, stoga postupak ima prigušujući karakter (Bagirova i sur., 2001.). Međutim, ako se u populaciji pojave procesi rekombinacije (seksualni ili paraseksualni), tada je moguće kombinirati različite roditeljske mutacije u hibridnom soju i ubrzati proces. Stoga populacije panmixa stječu otpor brže od agamičnih, a kod posljednjih populacije koje nemaju vegetativne barijere nekompatibilnosti brže od populacija podijeljenih takvim barijerama. S tim u vezi, prisustvo sojeva u populacijama koji se razlikuju po vrstama parenja ubrzava proces sticanja otpornosti na oligositne fungicide.
Drugi i treći faktor ne doprinose brzom nakupljanju sojeva otpornih na dimetomorf u populacijama. Svaka sljedeća mutacija približno udvostručuje otpor, što je beznačajno, a istovremeno smanjuje i brzinu rasta u umjetnom okruženju i agresivnost (Bagirova i sur., 2001; Stem, Kirk, 2004). Možda zato prirodno nema otpornih sojeva među prirodnim sojevima P. infestans, čak ni onih prikupljenih iz zasada krompira tretiranih dimetomorfom.
Populacija tretirana oligositnim fungicidom sastojat će se i od dvije skupine sojeva: onih koji nisu bili u kontaktu s fungicidom, pa stoga nisu promijenili početna svojstva (ako se u ovoj grupi nađu rezistentni sojevi, oni se neće akumulirati zbog veće agresivnosti i konkurentnosti osjetljivih sojeva), i sojevi u kontaktu sa koncentracijama subletala fungicida. Među posljednjima je moguća akumulacija otpornih sojeva, jer ovdje imaju prednosti u odnosu na osjetljive.
Stoga, kada se koriste oligositni fungicidi, nije toliko važan temeljni tretman koliko visoka koncentracija lijeka, nekoliko puta veća od smrtonosne doze, jer je kod stepenaste mutageneze početna rezistencija mutiranih sojeva mala.
Konačno, mutacije rezistencije na monositne fungicide su vrlo izražajne, odnosno jedna mutacija može zabilježiti visok nivo rezistencije do potpunog gubitka osjetljivosti. Stoga se porast otpora populacija javlja vrlo brzo.
Primjer takvih fungicida su fenilamidi, uključujući najčešći fungicid, metalaksil. Mutacije rezistencije na njega javljaju se vrlo često, a stupanj rezistencije kod mutanata je vrlo visok - premašuje osjetljivi soj za faktor od tisuću ili više (Derevyagina i sur., 1993). Iako se stopa rasta i agresivnost rezistentnih mutanata smanjuje u pozadini smrti osjetljivih sojeva od sistemskog fungicida, broj rezistentne populacije brzo raste, a paralelno s tim raste i njegova agresivnost. Stoga, nakon nekoliko godina upotrebe fungicida, agresivnost rezistentnih sojeva može ne samo izjednačiti agresivnost osjetljivih, već je i nadmašiti (Derevyagina i Dyakov, 1992).
Utjecaj na seksualnu rekombinaciju
Budući da se česta pojava tipa parenja A2 u populacijama P. infestans poklapala s intenzivnom upotrebom metalaksila protiv kasne bolesti, predloženo je da metalaksil indukuje konverziju tipa parenja. U P. parasitica je eksperimentalno dokazana takva konverzija pod dejstvom hloroneba i metalaksila (Ko, 1994). Jedan prolaz na medijumu s niskom koncentracijom metalaksila doveo je do nastanka homotalnih izolata iz soja P. infestans osjetljivog na metalaksil s tipom parenja A1 (Savenkova i Cherepnikova-Anikina, 2002). Tijekom sljedećih prolaza na medijima s većom koncentracijom metalaksila, nije pronađen niti jedan izolat tipa uparivanja A2; međutim, većina izolata, kada su se ukrstili s izolatima A2, umjesto oospora, stvorile su ružne nakupine micelija i bile su sterilne. Prolazi otpornog soja koji ima A2 tip parenja na medijima s visokom koncentracijom metalaksila omogućili su nam da otkrijemo tri oblika promjena tipa parenja: 1) potpuna sterilnost kada se ukršta sa izolatima A1 i A2; 2) homotalizam (stvaranje oospora u monokulturi); 3) konverzija tipa parenja A2 u A1. Dakle, metalaksil može uzrokovati promjene u vrstama parenja u populacijama P. infestans i, posljedično, seksualnu rekombinaciju u njima.
Efekti na vegetativnu rekombinaciju
Neki geni otpornosti na antibiotike povećali su učestalost hifalne heterokariotizacije i nuklearne diploidizacije (Poedinok i Dyakov, 1981). Kao što je ranije napomenuto, heterokariotizacija hifa tokom fuzije različitih sojeva P. infestans javlja se vrlo rijetko zbog fenomena vegetativne nekompatibilnosti ove gljive. Međutim, geni za rezistenciju na neke antibiotike mogu imati neželjene efekte, izražene u prevladavanju vegetativne nekompatibilnosti. Ovu osobinu posjedovao je 1S-1 mutirani gen za rezistenciju na streptomicin. Prisustvo takvih mutanata u poljskim populacijama fitoftore može povećati protok gena između sojeva i ubrzati prilagođavanje čitave populacije novim sortama ili fungicidima.
Određeni fungicidi i antibiotici mogu uticati na učestalost mitotičke rekombinacije, što takođe može promeniti učestalost genotipa u populacijama. Široko korišteni fungicid benomil veže se za beta-tubulin, protein iz kojeg se grade mikrotubule citoskeleta, i time remeti procese razdvajanja hromozoma u anafazi mitoze, povećavajući učestalost mitotske rekombinacije (Hastie, 1970).
Isti svojstvo ima i fungicid para-fluorofenilalanin, koji se koristi za liječenje holandske bolesti kod brijestova. Para-fluorofenilalanin povećao je učestalost rekombinacije u heterozigotnim diploidima P. infestans (Poedinok i sar., 1982).
Ciklične promjene u genotipskom sastavu populacija u životnom ciklusu P. infestans
Klasični razvojni ciklus P. infestans u umjerenom pojasu sastoji se od 4 faze.
1) Faza eksponencijalnog rasta populacije (policiklična faza) sa kratkim generacijama. Ova faza obično počinje u julu i traje 1,5-2 mjeseca.
2) Faza zaustavljanja rasta populacije usled naglog smanjenja udela netaknutog tkiva ili nastupa nepovoljnih vremenskih uslova. Ova faza na farmama koje provode rano uklanjanje lišća prije berbe ispada iz godišnjeg ciklusa.
3) Faza zimovanja u gomoljima, praćena značajnim smanjenjem broja populacije uslijed slučajne infekcije gomolja, sporog razvoja infekcije u njima, odsustva ponovne infekcije gomolja, truljenja i uklanjanja zahvaćenih gomolja u normalnim uvjetima skladištenja.
4) Faza usporenog razvoja u tlu i na sadnicama (monociklična faza), u kojoj trajanje generacije može doseći mjesec dana i više (kraj maja - početak jula). Obično je u to vrijeme bolesno lišće teško otkriti, čak i uz posebna zapažanja.
Faza eksponencijalnog rasta stanovništva (policiklična faza)
Brojna zapažanja (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) pokazala su da na početku epifitota prevladavaju nisko virulentni i blago agresivni klonovi, koji se potom zamjenjuju virulentnijim i agresivnijim. stopa rasta agresivnosti populacije je veća što je sorta domaćina manje otporna.
Kako populacija raste, povećava se koncentracija i selektivno važnih gena uvedenih u komercijalne sorte (R1-R4) i selektivno neutralnih (R5-R11). Dakle, u populacijama u blizini Moskve 1993. godine, prosječna virulencija od kraja jula do sredine avgusta povećala se sa 8,2 na 9,4, a najveći porast zabilježen je za selektivno neutralni gen virulencije R5 (sa 31 na 86% virulentnih klonova) (Smirnov, 1996. ).
Smanjenje stope rasta populacije praćeno je smanjenjem parazitske aktivnosti stanovništva. Stoga su u depresivnim godinama ukupan broj rasa i udio visoko virulentnih rasa niži nego u epifitoznih (Borisenok, 1969). Ako se na vrhuncu epifitoznih vremenskih uslova promijene u nepovoljne za kasnu bolest i zaraza krompirom smanji, koncentracija visoko virulentnih i agresivnih klonova takođe se smanjuje (Rybakova et al., 1987).
Povećanje učestalosti gena koji utiču na virulenciju i agresivnost populacije može biti posljedica odabira virulentnijih i agresivnijih klonova u mješovitoj populaciji. Da bi se demonstrirala selekcija, razvijena je metoda za analizu neutralnih mutacija koja je uspješno korištena u kemostatskim populacijama kvasca (Adams i sur., 1985) i Fusarium graminearum (Wiebe i sur., 1995).
Učestalost mutanata rezistentnih na blasticidin S u poljskoj populaciji P. infestans smanjila se paralelno s rastom agresivnosti populacije, što ukazuje na promjenu dominantnih klonova u procesu rasta populacije (Rybakova i sar., 1987).
Faza zimovanja u krtolama
Tokom zimovanja u krtolama krompira, virulencija i agresivnost sojeva P. infestans smanjuju se, a smanjenje virulencije događa se sporije od agresivnosti (Rybakova i Dyakov, 1990). Očigledno su, u uslovima pogodnim za brzi rast veličine populacije (r-selekcija), korisni "ekstra" geni virulencije i velika agresivnost, pa je razvoj epifitotika popraćen odabirom naj virulentnijih i najagresivnijih klonova. U uvjetima zasićenja okoline, kada ne važnu ulogu igra brzina razmnožavanja, već trajanje postojanja u nepovoljnim uvjetima (K-selekcija), "ekstra" geni virulencije i agresivnosti smanjuju kondiciju, a klonovi s tim genima prvi izumiru, tako da prosječna agresivnost i virulencija stanovništva opada.
Faza vegetacije u tlu
Ova je faza najmisterioznija u životnom ciklusu (Andrivon, 1995). Njegovo postojanje pretpostavljeno je čisto špekulativno - zbog nedostatka informacija o tome šta se s patogenom događa tokom dužeg perioda (ponekad i više od mjesec dana) - od pojave sadnica krumpira do pojave prvih mjesta na njima. Na osnovu opažanja i eksperimenata rekonstruisano je ponašanje gljive u ovom životnom periodu (Hirst i Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulacija gljive može nastati na zaraženim gomoljima u tlu. Rezultirajuće spore klijaju s hifama, koje mogu dugo vegetirati u tlu. Primarne (nastale na gomoljima) i sekundarne (na miceliju u tlu) spore se kapilarnim strujama podižu na površinu tla, ali stiču sposobnost zaraze krompira tek nakon što se donji listovi spuste i dođu u kontakt s površinom tla. Takvi listovi (na njima se nalaze prva mjesta bolesti) ne nastaju odmah, već nakon dugotrajnog rasta i razvoja vrhova krompira.
Dakle, faza saprotrofne vegetacije može postojati i u životnom ciklusu P. infestans. Ako je u parazitskoj fazi životnog ciklusa agresivnost najvažnija komponenta kondicije, onda je u saprotrofnoj fazi cilj smanjenja parazitskih svojstava, kao što je eksperimentalno pokazano za neke fitopatogene gljive (vidi Carson, 1993). Stoga u ovoj fazi ciklusa agresivna svojstva treba najintenzivnije izgubiti. Ali do sada nisu provedeni direktni eksperimenti koji bi potvrdili gore navedene pretpostavke.
Sezonske promjene utječu ne samo na patogena svojstva P. infestans, već i na otpornost na fungicide, koja raste u policikličkoj fazi (tokom epifitotija), a smanjuje se tokom skladištenja zimi (Derevyagina et al., 1991; Kadish i Cohen, 1992). Posebno intenzivan pad otpornosti na metalaksil zabilježen je između sadnje zahvaćenih gomolja i pojave prvih mjesta bolesti na terenu.
Intraspecifična specijalizacija i njen razvoj
P. infestans uzrokuje epidemije u dvije komercijalno važne kulture, krompiru i paradajzu. Epifitotije na krompiru započele su ubrzo nakon što je gljiva ušla u nova područja. Poraz paradajza zabilježen je i nedugo nakon pojave infekcije na krompiru, ali epifitoze na paradajzu zabilježene su tek stotinu godina kasnije - sredinom XNUMX. vijeka. Evo šta Hallegli i Niederhauser pišu o porazu paradajza u SAD-u
(1962): „Otprilike 100 godina nakon teške epifitoze 1845. godine nije bilo malo ili gotovo nikakvih pokušaja dobijanja rezistentnih sorti paradajza. Iako je kasna plamenjača prvi put zabilježena na paradajzu već 1848. godine, ona nije postala predmetom ozbiljne pažnje uzgajivača na ovoj biljci sve do jakog izbijanja bolesti 1946. godine. Na teritoriji Rusije kasna bolest paradajza registrovana je u 60. veku. „Dugo vremena istraživači nisu obraćali pažnju na ovu bolest, jer nije prouzrokovala značajnu ekonomsku štetu. Ali 70-ih i 1979-ih. Epifitotije XX vijeka kasne mrlje na paradajzu uočene su u Sovjetskom Savezu, uglavnom u regiji Donje Volge, Ukrajini, Sjevernom Kavkazu, Moldaviji ... “(Balashova, XNUMX).
Od tada je paradajzova bolest pojavom jednogodišnje štetočine postala godišnja, proširila se na cijelom teritoriju industrijskog i kućnog uzgoja i nanosi ogromnu ekonomsku štetu ovoj kulturi. Šta se desilo? Zašto se gotovo istovremeno pojavila prva pojava parazita na krompiru i epifitozna lezija ove kulture i zašto je trebalo stoljeće da se epifitotik pojavi na paradajzu? Te razlike podržavaju meksički, a ne južnoamerički izvor zaraze. Ako je vrsta Phytophthora infestans nastala kao parazit meksičkih gomoljastih vrsta roda Solanum, onda je razumljivo zašto je uzgojeni krumpir koji pripada istom dijelu roda kao i meksička vrsta bio tako snažno pogođen, ali zbog odsustva koevolucije s parazitom, koji nije razvio mehanizme specifične i nespecifične rezistencije.
Paradajz pripada drugom odjeljku roda, tip njegove razmjene ima značajne razlike od gomoljaste vrste, stoga, uprkos činjenici da paradajz nije izvan prehrambene specijalizacije P. infestans, intenzitet njegovog poraza bio je nedovoljan za ozbiljne ekonomske gubitke.
Pojava epifitozija na paradajzu posljedica je ozbiljnih genetskih promjena u parazitu, koje su povećale njegovu sposobnost (patogenost) tijekom parazitizma. Vjerujemo da je novi oblik specijaliziran za parazitiranje paradajza rasa T1 koju je opisao M. Gallegly, a koja utječe na sorte čeri paradajza (Red Cherry, Ottawa), otporne na rasu T0 rasprostranjenu na krumpiru (Gallegly, 1952). Očigledno, mutacija (ili niz mutacija) koja je pretvorila T0 rasu u T1 rasu i dovela do pojave klonova visoko prilagođenih za poraz paradajza. Kao što se često događa, porast patogenosti za jednog domaćina praćen je smanjenjem za drugog, odnosno nastala je početna, još ne potpuna intraspecifična specijalizacija - za krompir (rasa T0) i rajčicu (rasa T1).
Koji su dokazi za ovu pretpostavku?
- Pojava na krompiru i paradajzu. Na lišću rajčice prevladava rasa T1, dok je na lišću krumpira rijetka. Prema S.F.Bagirovoj i T.A. Orešonkova (neobjavljeno) u Moskovskoj regiji 1991-1992., Pojava T1 rase u zasadima krompira bila je 0%, a u zasadima paradajza - 100%; u periodu 1993-1995 - 33%, odnosno 90%; 2001. godine - 0% i 67%. Slični podaci dobijeni su u Izraelu (Cohen, 2002). Eksperimenti s infekcijom gomolja krompira izolatima rase T1 i smjesom izolata T0 i T1 pokazali su da su izolati rase T1 slabo očuvani u gomoljima i zamijenjeni su izolatima rase T0 (Dyakov i sur., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamika rase T1 u zasadu paradajza. Primarna infekcija lišća paradajza vrši se izolatima rase T0, koji dominiraju u analizi infekcije na prvim mjestima formiranim na lišću. Ovo potvrđuje općenito prihvaćenu shemu migracije parazita: Glavnu masu zaraze krumpirom stvara rasa T0, međutim, mali broj T1 klonova sačuvanih u krumpiru, jednom na rajčici, istiskuje rasu T0 i akumulira se pred kraj epifitotskog razdoblja. Moguće je i da postoji alternativni izvor zaraze lišća paradajza rasom T1, ne tako moćan kao gomolji i lišće krompira, ali konstantan. Stoga ovaj izvor slabo utječe na genetsku strukturu populacije koja zarazi paradajz, ali naknadno određuje nakupljanje rase T1 (Rybakova, 1988; Dyakov i sur., 1994).
3) Agresivnost na krompir i paradajz. Umjetna infekcija lišća paradajza i krumpira izolatima rasa T0 i T1 pokazala je da su prvi agresivniji za krompir nego za paradajz, a drugi agresivniji za paradajz nego za krompir. Te se razlike očituju u premještanju izolata ne-vlastite rase iz mješovite populacije tokom prolaska na lišću u stakleniku (Dyakov i sar., 1975) i na poljskim parcelama (Leberton i sar., 1999); razlike u minimalnom zaraznom opterećenju, razdoblju latencije, veličini zaraznih mjesta i stvaranju spora (Rybakova, 1988; Dyakov i sur., 1994; Legard i sur., 1995; Forbes i sur., 1997; Oyarzun i sur., 1998; Leberton i sur. dr., 1999; Vega-Sanchez i dr., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna i dr., 2004).
Agresivnost izolata rase T1 na sorte paradajza kojima nedostaju geni otpora toliko je visoka da se ti izolati spore na lišću kao na hranjivom mediju, a da nekrotiziraju zaraženo tkivo (Dyakov i sur., 1975; Vega-Sanchez i sur., 2000).
4) Virulencija za krompir i paradajz. T1 rasa pogađa sorte cherry paradajza sa genom za otpornost Ph1, dok rasa T0 nije sposobna zaraziti ove sorte, tj. ima užu virulenciju. U odnosu na diferencijatore
R-geni krompira su obrnuto povezani, tj. sojevi izolirani iz lišća paradajza manje su virulentni od sojeva "krompira" (Tabela 11).
5) Neutralni markeri. Analiza neutralnih markera u populacijama P. infestans koji parazitiraju na krompiru i paradajzu takođe svjedoči o višesmjernoj intraspecifičnoj selekciji. U brazilskim populacijama P. infestans, izolati listova paradajza pripadali su klonskoj liniji US-1, a oni iz lišća krompira BR-1 (Suassuna et al., 2004). Na Floridi (SAD) od 1994. godine na krompiru počinje dominirati klon US-90 (s pojavom većom od 8%), a klonovi US-11 i US-17 na paradajzu, a izolati potonjeg agresivniji su za paradajz nego za krompir (Weingartner , Tombolato, 2004). Značajne razlike u učestalosti genotipa (DNK otisci prstiju) u izolatima krompira i paradajza utvrđene su za 1200 sojeva P. infestans prikupljenih u Sjedinjenim Državama od 1989. do 1995. (Deahl i sur., 1995).
Upotrebom AFLP metode omogućeno je odvajanje 74 soja prikupljenih sa lišća krompira i paradajza u periodu 1996-1997. u Francuskoj i Švicarskoj, u 7 grupa. Sojevi krompira i paradajza nisu se jasno razlikovali, ali sojevi "krompira" bili su genetski raznolikiji od sojeva "paradajza". Prvi su pronađeni u svih sedam klastera, a drugi samo u četiri, što ukazuje na specijalizovaniji genom drugog (Knapova i Gisi, 2002).
6) Mehanizmi izolacije. Ako populacije parazita na dvije vrste biljaka domaćina evoluiraju prema sužavanju specijalizacije na svog „vlastitog“ domaćina, tada se javljaju različiti pre- i postmejotični mehanizmi koji sprečavaju interpopulacijske genetske razmjene (Dyakov i Lekomtseva, 1984).
Nekoliko studija je istraživalo efekat izvora roditeljskih sojeva na efikasnost hibridizacije. Kada su sojevi izolirani iz različitih vrsta roda Solanum ukršteni u Ekvadoru (Oliva i sur., 2002), utvrđeno je da su sojevi tipa A2 parenja divljih noćnih sjena (klonska linija EC-2) najlošije prešli sa sojevima paradajza (linija EC -3), a najučinkovitije je ukršteno sa sojem krompira (EC-1).
Utvrđeno je da svi hibridi nisu patogeni. Autori vjeruju da je nizak postotak hibridizacije i smanjenje patogenosti hibrida posljedica postmejotičkih mehanizama reproduktivne izolacije populacija.
U eksperimentima Bagirove i suradnika (1998), veliki broj sojeva krompira i paradajza ukršten je sa svojstvima rasa T0 i T1. Najplodniji su bili ukrštanja sojeva T1xT1 izolovanih iz paradajza (36 oospora u vidnom polju mikroskopa, 44% klijavosti oospore), a najmanje efikasni bili su ukrštanja rasa T0xT1 izolirani od različitih domaćina (mali broj razvijajućih i klijavih oospora, visok udio abortivnih i nerazvijenih oospora) ... Učinkovitost ukrštanja izolata rase T0 izoliranih iz krompira bila je srednja. Budući da glavnina sojeva rase T0 utječe na krompir, on ima pouzdan izvor zimovanja - gomolje krompira, što je rezultiralo time da je važnost oospora kao zimovalištih zaraznih jedinica za populacije od krumpira mala. Prilagođeni „oblik rajčice“ može prezimiti na paradajzu u obliku oospora (vidi dolje) i stoga zadržava veću produktivnost seksualnog procesa. Zbog visoke plodnosti, T1 stječe neovisni potencijal za primarnu infekciju u paradajzu. Rezultati dobiveni od Knapove i dr. (Knapova i dr., 2002) mogu se tumačiti na isti način. Križevi sojeva izolovanih od krompira i sojeva paradajza dali su najveći broj oospora - 13,8 po kvadratnom metru. srednje (sa širenjem od 5-19) i srednjim procentom klijavosti oospora (6,3 sa širenjem od 0-24). Ukrštanja sojeva izolovanih iz paradajza dala su najmanji procenat oospora (7,6 sa širenjem od 4-12), a najveći procenat njihove klijavosti (10,8). Ukrštanjem sojeva izoliranih iz krompira dobiven je srednji broj oospora (8,6 s velikim raspršivanjem podataka - 0-30) i najmanji procenat klijavosti oospora (2,7). Dakle, sojevi krompira su manje plodni od onih paradajza, ali interpopulacijski križanje nije dao lošije rezultate od intrapopulacionih. Moguće je da razlike sa gornjim podacima Bagirove i dr. objašnjavaju se činjenicom da su ruski istraživači radili sa sojevima izoliranim početkom 90-ih godina dvadesetog vijeka, a švicarski istraživači - sa sojevima izoliranim krajem 90-ih.
Osnova za nisku plodnost može biti heteroploidija sojeva. Ako su u meksičkim populacijama, gdje su spolni proces i primarna infekcija potomstvom oospore redoviti, većina proučavanih sojeva P. Infestans diploidni, tada se u zemljama Starog svijeta primjećuje polimorfizam ploidije (di-, tri- i tetraploidni sojevi, kao i heterokariotski sojevi s heteroploidnim jezgrima) i sojevi koji imaju različite vrste parenja, tj. međusobno plodne, razlikuju se u nuklearnoj ploidiji (Therrien i sur., 1989, 1990; Whittaker i sur., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Raznolikost jezgara u anteridijama i oogoniji može biti razlog niske plodnosti.
Što se tiče nuklearne razmjene između hifa tijekom anastomoza, to sprečava vegetativna nekompatibilnost, koja dijeli aseksualne populacije na mnoge genetski izolirane klonove (Poedinok i Dyakov, 1987; Gorbunova i sur., 1989; Anikina i sur., 1997b).
7) Konvergencija populacija. Navedeni podaci ukazuju da je moguća hibridizacija između sojeva P. infestans "krompir" i "paradajz". Moguća je i uzajamna ponovna infekcija različitih domaćina, iako sa smanjenom agresivnošću.
Studija populacionih markera u izolatima sa susednih polja krompira i paradajza 1993. godine pokazala je da je oko četvrtine izolata izolovanih iz listova paradajza prebačeno sa susednog polja krompira (Dolgova i sar., 1997). Teoretski, moglo bi se pretpostaviti da će se divergencija populacija na dva domaćina povećati i dovesti do pojave specijaliziranih intraspecifičnih oblika (f.sp. krompir i f.sp. paradajz), pogotovo jer oospore mogu trajati u biljnim ostacima (Drenth i sur., 1995. ; Bagirova, Dyakov, 1998) i sjeme paradajza (Rubin i sur., 2001). Zbog toga paradajz trenutno ima izvor proljetne regeneracije neovisno o gomoljima krompira.
Međutim, sve se dogodilo drugačije. Prezimljenje oosporama omogućilo je parazitu da izbjegne najuži stadij u svom životnom ciklusu - monociklički stadij vegetacije u tlu, tokom kojeg se smanjuju parazitska svojstva koja se ljeti postepeno obnavljaju u policikličkoj fazi.
Tabela 11. Učestalost gena virulencije za sorte diferencijatora krompira u sojevima P. infestans
zemlja | Godina | Prosječan broj gena virulencije u sojevima | autor | |
od krompira | od paradajza | |||
Francuska | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton i dr., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francuska, Švicarska | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
США | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin i dr., 1995 |
SAD, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance et al., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Эквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun i dr., 1998 |
Izrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusija, Mosk. region | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusija, različite regije | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja i drugi. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primarne zoosporangije i zoospore, koje klijaju oospore, imaju visok stepen parazitske aktivnosti, posebno ako su oospore nastale partenogenetički pod uticajem feromona soja sa suprotnom vrstom parenja. Stoga je zarazni materijal na sadnicama paradajza uzgojenim od sjemena zaraženih oosporama visoko patogen i za paradajz i za krompir.
Ove promjene dovele su do novog restrukturiranja stanovništva, izraženog u sljedećim važnim promjenama s epidemiološkog stajališta:
- Zaražene sadnice paradajza postale su važan izvor primarne zaraze krumpira (Filippov, Ivanyuk, lične poruke).
- Epifitozije na krompiru počele su se primjećivati već u junu, otprilike mjesec dana ranije nego obično.
- U zasadima krompira povećao se procenat rase T1, koji je tamo ranije pronađen u neznatnoj količini (Ulanova i sar., 2003).
- Sojevi izolirani iz lišća paradajza više se nisu razlikovali od sojeva krompira po virulenciji na diferencijatorima gena virulencije krompira i počeli su da nadmašuju sojeve „krompira“ agresivnošću ne samo na paradajzu, već i na krompiru (Lavrova i sar., 2003; Ulanova i sar. , 2003).
Dakle, umjesto divergencije, došlo je do konvergencije populacija, pojave jedne populacije na dvije biljke domaćina s velikom virulencijom i agresivnošću na obje vrste.
zaključak
Dakle, uprkos više od 150 godina intenzivnog proučavanja P. infestans, u biologiji, uključujući populacionu biologiju ovog uzročnika najvažnijih bolesti gajenih biljaka solanaceous, mnogo toga ostaje nepoznato. Nije jasno kako prolazak pojedinih faza životnog ciklusa utječe na strukturu populacija, koji su genetski mehanizmi kanalizirane varijabilnosti agresivnosti i virulencije, koliki je odnos reproduktivnog i klonskog sistema razmnožavanja u prirodnim populacijama, kako se nasljeđuje vegetativna nekompatibilnost, kakva je uloga krumpira i paradajza u primarnoj zarazi ovih kultura i u kakav je njihov utjecaj na populacijsku strukturu parazita. Do sada nisu riješena tako važna praktična pitanja kao što su genetski mehanizmi za promjenu agresivnosti parazita ili erozija nespecifične rezistencije krumpira. Produbljivanjem i proširivanjem istraživanja na krompirovoj karijesu, parazit postavlja nove izazove istraživačima. Međutim, poboljšanje eksperimentalnih sposobnosti, pojava novih metodoloških pristupa manipulaciji genima i proteinima omogućavaju nam da se nadamo uspješnom rješenju postavljenih pitanja.
Članak je objavljen u časopisu "Zaštita krompira" (br. 3, 2017)